本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。
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本文内容
摘要
摘要
类器官是一种可靠的器官组织模型构建方法，因其具有自我组织特性，并能在从原代组织或干细胞扩增后仍保留其功能与结构。本类器官生成方法无需通过多次传代进行单细胞分化，而是采用差速离心法，从经机械和酶解方法解离的组织中分离乳腺上皮类器官。本实验方案提供了一种简化的技术，可快速从小鼠和人乳腺组织中生成小型和大型上皮类器官，并包含类器官在胶原蛋白和基底膜细胞外基质中的包埋技术。此外，还提供了凝胶内固定及免疫荧光染色的操作步骤，用于观察类器官的形态与密度。这些方法适用于多种下游分析，例如与免疫细胞共培养 离体 转移建模 通过 胶原侵袭实验。这些分析有助于更清晰地阐明细胞间的相互行为，并更全面地理解肿瘤微环境中的相互作用。
引言
上皮细胞建模能力 体外 一直是现代生物医学研究的基础，因为它能够捕捉到其他方法无法获取的细胞特征 体内例如，在二维平面上培养上皮细胞系可用于评估上皮细胞在增殖过程中发生的分子变化1此外，对信号传导与基因表达之间动态调控的测量仍存在局限性 体内 系统2在癌症研究中，癌上皮细胞系建模已助力识别疾病进展的分子驱动因素及潜在药物靶点3然而，在二维平面上培养癌性上皮细胞系存在局限性，因为这些细胞系大多经过遗传性永生化和修饰，通常具有克隆性，是在非生理条件下筛选出的能够生长的细胞，难以准确评估三维（3D）肿瘤组织结构，也无法充分模拟真实组织环境中微环境之间的相互作用4这些限制在模拟转移过程中尤为明显，这 体内 包括多个不同的生物学阶段，如侵袭、播散、循环以及在远端器官部位的定植5.
已开发出癌性上皮类器官，以更好地模拟肿瘤的三维环境和行为6,7,8。类器官最初由单个LRG5+肠隐窝细胞培养而来，并....
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方案
本研究中使用的所有小鼠组织均按照德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定和指南，以符合伦理的方式采集。同样，所有患者均在机构审查委员会（IRB）的监督下，于组织捐献前签署知情同意书，且样本均已去标识化。
注意：本方案描述了从原代组织生成类器官的方法。
1. 材料的过夜准备
- 对于在基底外基质（BECM）中的包埋，将BECM分装样品置于4 °C下解冻。
2. 准备胶原酶和牛血清白蛋白（BSA）包被溶液
- 制备 2.64% BSA/PBS 包被溶液（BSA 溶液）：使用 50 mL/0.2 µm 滤器对 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）和 4.10 mL 30% BSA 溶液进行无菌过滤。该 BSA 溶液可再次过滤后重复使用。
- 制备小鼠乳腺组织用胶原酶溶液：使用 50 mL/0.2 µm 滤器对 27 mL 基础细胞培养基、1.5 mL 胎牛血清（FBS）、30 µL 50 mg/mL 庆大霉素、15 µL 10 mg/mL 胰岛素、600 µL 0.1 g/mL 胶原酶 A 和 600 µL 0.1 g/mL 胰蛋白酶进行无菌过滤。根据组织质量，每只小鼠分配 10 mL 至 30 mL 胶原酶溶....
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结果
本文所展示的图像均来自 图 1 提供一个来自人类和小鼠组织的野生型与肿瘤性乳腺上皮类器官的示例。通过差速离心分离上皮类器官的方法概览，以卡通流程图的形式呈现。 图 1A这表明，来自不同物种的原代组织可以采用近乎相同的方式进行处理，同时获得上皮组织，如明场图像所示（图 1B此外，这些跨物种组织组成的相似性，在包埋于基底膜细胞外基质或胶原中的类器官的免疫荧光图像中亦可见，如图 图 2A-D类器官结构可通过膜番茄红蛋白（mTomato）标记或肌动蛋白鬼笔环肽染色进行可视化。这些图像也展示了采用该方法所预期的类器官组成与尺寸。包埋于胶原基质中的类器官可用于侵袭实验，并通过追踪从类器官本身分支出的触须状结构的扩展情况进行分析，如图所示。 图 2C最后，使用苏木精和伊红（H&E）染色对组.......
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讨论
文献中已描述了多种生成肿瘤类器官的方法。本方案重点介绍一种直接从肿瘤组织中生成肿瘤类器官而不进行传代的方法。采用该方法，可在启动实验数小时内获得肿瘤类器官，且类器官存活率接近100%，而文献报道的存活率约为70%31。相比之下，其他方法需要将细胞连续传代培养为类器官，耗时数周。因此，本方法使得下游应用更具可行性，例如在无需长期培养干扰的情况下，研究来自同一宿主的匹配类器官与免疫细胞样本之间的相互作用并进行可视化分析。此外，如图2C所示，将肿瘤类器官包埋于不同的细胞外基质中，有助于识别转移级联过程中关键的表型特征，例如从原发肿瘤中侵袭而出。其他下游应用还包括分支形态发生32、侵袭、播散和克隆形成33等表型检测，用于评估多种上皮细胞行为。这些基于类器官的检测方法还可实现对免疫相互作用的功能性与可视化捕获。此外，可通过溶解凝胶回收包埋的细胞，进而利用常规的生物化学和基于流式的检测方法对基因和蛋白成分进行下游分析。最后，由于可从肿瘤组织中快速获.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究获得了 METAvivor、Peter Carlson 信托基金、Theresa's 研究基金会以及 NCI/UTSW Simmons 癌症中心 P30 CA142543 项目资助。我们感谢德克萨斯大学西南医学中心组织管理共享资源（Simmons 综合癌症中心的共享资源）提供的协助，该资源部分由美国国家癌症研究所资助，资助编号为 P30 CA142543。特别感谢 Chan 实验室的所有成员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mM HEPES 缓冲液 | Gibco | 15630080 | |
| 100x 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | 谷氨酰胺补充剂 |
| 100x 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS） | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm 滤器瓶 | Fisher | #564-0020 | |
| 两性霉素 B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA 溶液（32%） | Sigma | #A9576 | |
| 霍乱毒素 | Sigma | C8052 | |
| CO2-非依赖性培养基 | Gibco | 18045-088 | |
| 胶原酶 A | Sigma | C2139 | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase） | Sigma | D4263 | |
| 含 4500 mg/L 葡萄糖、丙酮酸钠和碳酸氢钠，不含 L-谷氨酰胺的 DMEM 液体培养基，经无菌过滤，适用于细胞培养 | Sigma | D6546 | 常用基础培养基 |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | 基础细胞培养基 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Sigma | #D8662 | PBS |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | #F0926 | |
| 庆大霉素 | Life Technologies | #15750-060 | |
| 人表皮生长因子（EGF） | Sigma | E9644 | |
| 氢化可的松 | Sigma | H0396 | |
| 胰岛素 | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | 基底膜细胞外基质（BECM） |
| NaOH（1 N） | Sigma | S2770 | |
| 大鼠尾胶原 I 型 | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 培养基 | Fisher | SH3002701 | |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | 27250-018 |
参考文献
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Fron....
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重印与许可
