在这里,我们提出了一种使用逆流离心系统以封闭的半自动方式从多层烧瓶中收获贴壁细胞的方案。该协议可用于从其他细胞扩增平台收获贴壁和悬浮细胞,只需对现有步骤进行少量修改。
人类间充质干细胞(hMSCs)目前正在被探索为一种有前途的基于细胞的治疗各种疾病的治疗方式,预计未来几年将有更多的市场批准用于临床应用。为了促进这一转变,解决规模、批次间重现性、成本、法规遵从性和质量控制的瓶颈至关重要。这些挑战可以通过关闭流程和采用自动化制造平台来解决。在这项研究中,我们开发了一种封闭的半自动工艺,用于使用逆流离心从多层烧瓶中传代和收获沃顿氏果冻(WJ)衍生的hMSC(WJ-hMSCs)。WJ-hMSCs使用符合法规的无血清无异种(SFM XF)培养基扩增,并且显示出与经典含血清培养基中扩增的WJ-hMSC相当的细胞增殖(群体倍增)和形态。我们的封闭式半自动收获方案显示出高细胞回收率(~98%)和活力(~99%)。使用逆流离心洗涤和浓缩的细胞保持WJ-hMSC表面标志物表达,集落形成单位(CFU-F),三系分化潜力和细胞因子分泌谱。研究中开发的半自动细胞收获方案可以通过直接连接到不同的细胞扩增平台以低输出体积进行体积减少、洗涤和收获,轻松应用于各种贴壁和悬浮细胞的中小规模处理。
人间充质干细胞(hMSCs)是临床应用的绝佳候选者,无论是在组织工程还是细胞治疗中,因为它们具有治疗潜力和高自我更新潜力,可以在体外生长,这对于产生临床相关剂量的细胞至关重要1,2,3。据 ClinicalTrials.gov 称,目前正在研究针对各种疾病状况的1,000多项临床试验4。鉴于对使用hMSCs的兴趣日益浓厚,在不久的将来,更多的临床试验和市场批准即将到来5,6。然而,hMSCs的制造在批次间差异性、高风险原材料的使用、许多开放和手动过程引起的污染问题方面存在许多固有的挑战,因为制造涉及多个单元操作,更高的劳动力成本,横向扩展或扩大的成本以及监管障碍6,7,8,9,10, 11,12.这些问题仍然是当前和未来市场准入的重大障碍。
开发封闭、模块化、自动化的生产解决方案和使用低风险的辅助试剂将应对这些挑战。这还将确保一致的产品质量,减少由于人为错误而导致批次失败的可能性,降低劳动力成本,并提高流程标准化和法规遵从性,例如在数字批次记录保存方面8,12,13,14。为了能够获得临床相关的细胞剂量,无论是自体还是同种异体,以封闭、自动化的方式涉及上游细胞扩增和下游处理的简化制造至关重要。
对于上游hMSC扩增,目前采用的两种最常见的制造方法是横向扩展(2D单层)和纵向扩展(基于3D微载体的悬浮系统)15,16,17,18。最传统和最广泛采用的hMSC扩增方法是基于2D单层的培养,因为它生产成本低且易于设置19。
由堆叠在培养容器内的平坦表面托盘组成的多层烧瓶通常用于扩大hMSC生产。这些系统通常采用1层至40层培养容器20 ,并在生物安全柜内手动处理。细胞传代和收获过程中的处理步骤包括通过移液或物理倾斜整个容器来手动分配和倾析膨胀培养基、解离试剂和洗涤缓冲液。此外,由于多个单元的尺寸和重量庞大,处理多个单元具有挑战性且耗时。
随后,从多层烧瓶中收获后、离心以进行培养基交换、细胞洗涤和体积减小是整个细胞制造工作流程中必不可少的步骤21。传统的台式离心大多是开放式和手动过程,涉及多个步骤,例如将细胞悬液转移到生物安全柜内的带盖管或瓶中,旋转细胞,手动吸出上清液,用缓冲液重悬细胞,以及重复细胞洗涤。这大大增加了由于盖子的打开和关闭而导致的污染风险以及在手动抽吸/移液过程中丢失细胞沉淀的机会22。在处理贴壁细胞(如hMSCs)的多层培养系统时,操作员需要经历一个费力的过程,在离心机和生物安全柜之间反复穿梭,同时处理一个重型单元。这些手动步骤费力,在人为错误和污染方面存在风险,并且必须在B级洁净室环境中进行,这是昂贵的23。此外,传统的手动离心过程不可扩展,可能导致细胞剪切和应力;因此,最大限度地提高细胞回收率、活力和残留杂质的洗脱效率是其他主要挑战22。细胞疗法的商业cGMP规模生产需要封闭的模块化自动化解决方案,以降低污染风险,确保一致的产品质量,降低劳动力和生产成本,并提高过程可靠性24,25。多层烧瓶可以作为一个封闭系统进行处理,方法是在其中一个端口中放置一个0.2μm无菌过滤器,以促进无菌气体交换,第二个端口通过连接器无菌连接或直接焊接到自动细胞处理仪器上进行细胞收获。我们通过评估用于生产细胞、基因或组织产品的创新型封闭式逆流离心机,致力于关闭和自动化 WJ-hMSC 传代和收获的大多数步骤。该逆流离心机还具有执行各种细胞处理应用的灵活性,例如基于大小的细胞分离、培养基/缓冲液交换、浓度和收获,适用于各种细胞类型8,26,27,28。该仪器使用封闭的一次性套件,可以使用管焊接或无菌连接器进行无菌连接以转移袋子,也可以直接连接到任何选择的扩展平台。
在这项研究中,我们设计了一个定制的管路组件,以允许一次性逆流离心试剂盒和多层烧瓶之间的封闭无菌连接。我们优化了一个方案,在单次运行中以完全封闭和半自动的方式从多层烧瓶中酶促分离、洗涤和收获WJ-MSC。对收获的WJ-hMSCs进行纯度(表面标志物分析)和效力(CFU-F、三系分化和细胞因子分泌谱)表征,以确保最终产品符合批次放行的关键质量属性(CQA)。
在这项工作中,我们已经展示了使用逆流离心仪器在工作台上关闭和半自动hMSC解离以及洗涤和收获的能力。整个工作流程中的关键步骤之一是确保管道按照逆流离心系统方案构建器中定义的预设方案进行连接。设置和操作简单,从试剂盒组装到细胞收获,从 10 层烧瓶处理约 2 L 培养物所需的时间约为 60 分钟。该工作流程中的限制步骤之一是将流体从多层烧瓶转移到连接到逆流离心仪器的转移袋。高流量一次性试剂盒只能以 165 mL/min 的最大流速运行,这对于处理(例如 40 层烧瓶)可能具有挑战性。为了加快流体转移过程,可以使用外部高流量泵首先将胰蛋白酶化的内容物转移到转移袋中,然后使用逆流离心系统洗涤/浓缩并从转移袋中收获细胞。此外,该协议还可用于传代4层至10层多层烧瓶的细胞。在上游,逆流离心系统也可以优化,以洗涤解冻的hMSCs,并将收获和培养基配方直接收获到多层烧瓶中以启动种子培养。应该注意的是,在逆流离心室中形成流化床所需的最小细胞数约为3000万个细胞,每批的最大推荐处理体积为20 L。
目前,在cGMP设置中,不希望将定制管组件连接到生物安全柜中的多层烧瓶上以及组件部件的高压灭菌。作为替代方案,可以将定制的伽马灭菌管组件外包给供应商。提供多层烧瓶的供应商还提供使用所需的管道组件(包括0.2 μm过滤器)预装烧瓶的选项,并对整个设备进行伽马灭菌。这将确保多层烧瓶和连接的管道真正封闭,这意味着该过程可以在C级洁净室环境中的工作台上完成。
利用逆流离心系统的该过程不仅限于多层容器中基于贴壁的培养细胞,并且可以适用于动态(搅拌罐或波浪生物反应器)和静态(透气)悬浮液的细胞扩增平台。具体来说,对于在3D微载体培养物中扩增的hMSC,可以在逆流离心系统上优化方案,以收获,洗涤和配制从微载体中解离的hMSC。
总体而言,人们对开发具有改进工艺稳健性和可靠性的转化细胞疗法的兴趣日益浓厚,这导致了封闭式自动化细胞处理平台的开发。这些系统势在必行,因为它们减少了处理步骤的数量,防止无菌连接的潜在污染,并通过减少劳动力和提高洁净室空间的有效利用来降低制造成本21。与此一致,许多正在寻求监管部门批准以转化其疗法的细胞治疗产品开发人员都意识到早在工艺开发阶段就关闭流程并实施完全自动化或半自动化的重要性14,31,32。
通过使用监管友好的SFM XF培养基,以及符合21 CFR GMP Part 11和国际质量指南的辅助试剂,这种半自动化工艺将很容易适用于临床生产。我们已经展示了封闭过程的可重复性和WJ-MSC的质量保持。 提高在多层烧瓶中培养贴壁细胞的效率和安全性不仅有利于hMSC治疗领域,而且有利于细胞系库和贴壁病毒生产的公司。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢来自新加坡A * STAR的行业调整基金预定位(IAF-PP)资金(H18 / 01 / a0 / 021和H18 / AH / a0 / 001)的支持。
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |