Het verkennen van de combinatiestrategie voor twee kruiden om gewonde PC12-cellen te behandelen
Summary
Dit protocol biedt een combinatiestrategie van twee kruiden om gewonde PC12-cellen te behandelen. Het protocol biedt een referentie voor het optimaliseren van de beste toepassingsmodus van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM).
Abstract
Met het oog op de voordelen van de combinatie van traditionele Chinese geneeskunde (TCM) bij de behandeling van cerebrale ischemie, bestudeerden we de verschillen in de werkzaamheid en het mechanisme tussen de bereidingscombinatie en de componentcombinatie om de twee kruidencombinatiestrategie te verkennen om gewonde PC12-cellen te behandelen. Kobaltchloride (CoCl2) in combinatie met een glucosevrij medium werd gebruikt om oxidatieve schade aan PC12-cellen te induceren. Vervolgens werd de optimale combinatie van Astragalus mongholicus (Ast) en Erigeron breviscapus (Eri) injectie geselecteerd en gecombineerd volgens uniforme ontwerpmethoden na screening van hun veilige en effectieve concentratie op PC12-cellen. Verder omvat de gescreende componentencombinatie 10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarine en 75 μM chlorogeenzuur in twee kruiden. Vervolgens werden MTT, Annexin V-FITC/PI, immunofluorescentie en Western blot-analyse gebruikt om de werkzaamheid en het mechanisme van de preparaatcombinatie en de componentcombinatie op gewonde PC12-cellen te evalueren. De resultaten toonden aan dat de optimale voorbereidingscombinatie voor celpro-overleving Ast-injectie en Eri-capsule was met een concentratie van 6:1,8 (μM). De componentencombinatie (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarine en 75 μM chlorogeenzuur) was werkzamer dan de bereidingscombinatie. Beide combinaties verminderden opmerkelijk de apoptotische snelheid, de fluorescentie-intensiteit van caspase-3 en het intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) -niveau; ondertussen verhoogden ze de expressieniveaus van p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax en Nrf2. Deze effecten waren duidelijker in de componentencombinatie. Kortom, beide combinaties kunnen de verwonding veroorzaakt door CoCl2 in combinatie met een glucosevrij medium op PC12-cellen remmen, waardoor de celoverleving wordt bevorderd. De efficiëntie van de componentcombinatie ten opzichte van de bereidingscombinatie kan echter te wijten zijn aan de sterkere regulatie van de PI3K / Akt / Nrf2-signaleringsroute gerelateerd aan oxidatieve stress en apoptose.
Introduction
Chronische cerebrale ischemie, veroorzaakt door cerebrale hypoperfusie, is een veel voorkomende ziekte bij mensen van middelbare leeftijd en ouderen1. Als een langdurige occulte ischemieziekte, kan het leiden tot progressieve of aanhoudende neurologische disfunctie. De belangrijkste pathologische mechanismen omvatten celapoptose en oxidatieve schade, wat leidt tot progressieve of aanhoudende neurologische disfunctie; dit is de pathologische basis van de ziekte van Alzheimer, vasculaire dementie en andere ziekten en heeft ernstige gevolgen voor de kwaliteit van leven van patiënten. Er is echter nog steeds een gebrek aan ideale medicijnen in de moderne geneeskunde om chronische cerebrale ischemie te behandelen2. Tegelijkertijd is de combinatie van Astragalus mongholicus (Ast) en Erigeron breviscapus (Eri) op grote schaal gebruikt in de klinische praktijk van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM)4. De combinatiestrategie is opmerkelijk verbeterd in het bevorderen van het herstel van de zenuwfunctie na cerebrale ischemie, wat beter is dan die van een enkel medicijn; er zijn echter grote verschillen in de doseringsverhouding in de combinatie van de twee geneesmiddelen4. De effectieve componenten en het werkingsmechanisme zijn niet goed gedefinieerd, wat het belangrijkste probleem is dat de klinische toepassing ervan beperkt.
Eerdere studies hebben het synergetische effect aangetoond van de combinatie van Ast-injectie en Eri-injectie bij de behandeling van cerebrale ischemie bij ratten. Het kan de expressie van p-Akt-eiwit upreguleren en de expressie van Bcl-2 associated death promoter (BAD) -eiwit 5,6 downreguleren, een van de B-lymfoblastoom 2 (Bcl-2) familie-eiwitten en heeft het effect van het bevorderen van apoptose. De materiële basis en het mechanisme van het synergetische effect zijn echter niet duidelijk. Verder is het letselmodel van PC12-cellen vastgesteld met CoCl2 gecombineerd glucosevrij medium en is de optimale componentencombinatie in Ast en Eri gescreend en gedefinieerd7.
In deze studie worden de effectieve doses Ast en Eri gescreend met behulp van het gewonde PC12-celmodel. De optimale combinatie van de twee geneesmiddelen wordt gescreend met behulp van dit model in combinatie met de homogene ontwerpmethode. Het celmodel wordt gebruikt om het verschil in de effecten en mechanismen van de voorbereidingscombinatie en de componentcombinatie in gewonde PC12-cellen verder te evalueren. Deze strategie is gericht op het onderzoeken van het beschermende effect en het regulerende mechanisme van de twee soorten combinaties op gewonde PC12-cellen via de PI3K / Akt / Nrf2-signaalroute om de beste combinatiemodus te bepalen. Deze studie biedt een referentie voor het optimaliseren van de beste toepassingsmodus van TCM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is nog steeds een gebrek aan ideale geneesmiddelen voor de behandeling van cerebrale ischemie in de moderne klinische praktijk2. Onder begeleiding van het aanvullen van qi en het activeren van de bloedcirculatiemethode zijn Ast, Eri en andere preparaten in combinatie gebruikt in de klinische praktijk van TCM en hebben goede uitgebreide voordelen bereikt 13,14,15. Een groot aantal studies hebben aangeto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door Key R &D-projecten van de Sichuan Provincial Department of science and technology (2020YFS0325).
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- . Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 (2020)
- . Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 (2020)
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer’s disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
