Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario
Summary
Aquí, describimos un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar los niveles de ADN monocatenario en las células. Este método eficiente y reproducible se puede utilizar para examinar el estrés de replicación, una característica común en varios cánceres de ovario. Además, este ensayo es compatible con una tubería de análisis automatizada, lo que aumenta aún más su eficiencia.
Abstract
El estrés de replicación es un sello distintivo de varios cánceres de ovario. El estrés de replicación puede surgir de múltiples fuentes, incluidas las roturas de doble cadena, los conflictos de transcripción-replicación o los oncogenes amplificados, lo que inevitablemente resulta en la generación de ADN monocatenario (ssDNA). La cuantificación de ssDNA, por lo tanto, presenta una oportunidad para evaluar el nivel de estrés de replicación en diferentes tipos de células y bajo diversas condiciones o tratamientos que dañan el ADN. La evidencia emergente también sugiere que el ssDNA puede ser un predictor de las respuestas a los fármacos quimioterapéuticos que se dirigen a la reparación del ADN. Aquí, describimos una metodología detallada basada en inmunofluorescencia para cuantificar ssDNA. Esta metodología consiste en etiquetar el genoma con un análogo de la timidina, seguido de la detección basada en anticuerpos del análogo en la cromatina en condiciones no desnaturalizantes. Los tramos de ssDNA se pueden visualizar como focos bajo un microscopio de fluorescencia. El número y la intensidad de los focos se relacionan directamente con el nivel de ssDNA presente en el núcleo. También describimos una tubería automatizada para cuantificar la señal de ssDNA. El método es rápido y reproducible. Además, la simplicidad de esta metodología la hace susceptible a aplicaciones de alto rendimiento, como exámenes genéticos y de medicamentos.
Introduction
El ADN genómico está frecuentemente expuesto a múltiples agresiones de diversas fuentes endógenas y exógenas1. La frecuencia de daño endógeno se correlaciona directamente con los niveles de subproductos metabólicos, como especies reactivas de oxígeno o aldehídos, que son intrínsecamente más altos en múltiples tipos de cáncer, incluidos los cánceres de ovario 2,3. Es imperativo que el daño al ADN se resuelva de manera eficiente; de lo contrario, puede fomentar lesiones genotóxicas y, en consecuencia, mutagénesis. La capacidad de las células para reparar lesiones genotóxicas depende de la funcionalidad de las vías de reparación del ADN libres de errores y la regulación eficiente de la progresión del ciclo celular en respuesta al daño del ADN. Cabe destacar que muchos cánceres de ovario portan mutaciones funcionalmente inactivantes en p53 y, por lo tanto, tienen un punto de control G1/S defectuoso, lo que lleva a las células a iniciar la replicación del ADN a pesar de la presencia de lesiones genómicas no reparadas 4,5. El grado de daño del ADN en los cánceres de ovario se ve agravado por la observación de que más del 50% del carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) tiene defectos en la recombinación homóloga mediada por BRCA1 y BRCA2, la vía de reparación del ADN libre de errores, y alrededor del 20% tiene amplificación en el gen CCNE1, que empuja prematuramente a las células G1 a la fase S6. . En conjunto, la alta frecuencia de daños endógenos en el ADN, los puntos de control defectuosos y el mal funcionamiento de las vías de reparación mejoran exponencialmente la acumulación de lesiones genómicas en los cánceres de ovario. Estas lesiones pueden servir como impedimentos para la progresión de procesos celulares críticos como la replicación y transcripción del ADN. Como se discute más adelante, tales impedimentos catalizan la generación de ADN monocatenario (ssDNA) en las células.
La doble hélice del ADN es crítica para salvaguardar el genoma de múltiples procesos mutagénicos, como la depurinación espontánea y la despirimidinación, la actividad de las citosina desaminasas y el daño oxidativo del ADN 1,7. En contraste, el ssDNA es altamente vulnerable a estos eventos mutacionales. Múltiples procesos en las células pueden resultar en la generación de ssDNA (Figura 1). Entre ellas se incluyen las siguientes:
(i) Estancamiento de la maquinaria de replicación del ADN: Esto conduce a un desacoplamiento de la helicasa del ADN y la polimerasa, dejando tramos de ssDNA 8,9.
(ii) Estancamiento de la maquinaria de transcripción: El estancamiento persistente de la ARN polimerasa conduce a la generación de estructuras híbridas de ADN/ARN de tres cadenas llamadas bucles R. La formación de R-loop expone el ADN desplazado y no transcrito como una sola hebra10.
(iii) Resección final del ADN: El inicio de la reparación dirigida por homología requiere la generación de un 3′ ssDNA para catalizar la búsqueda de una secuencia homóloga11.
(iv) D-loop: La invasión de hebras durante la recombinación homóloga puede resultar en el desplazamiento de la cadena complementaria no plantilla, lo que resulta en ssDNA12.
(v) Brechas acopladas a la replicación: Durante la replicación del ADN, la síntesis de hebras rezagadas ocurre de manera discontinua, por lo que los fragmentos de Okazaki se generan primero y luego se ligan. Un retraso o defecto en el procesamiento de los fragmentos de Okazaki también puede resultar en la formación de ssDNA. Finalmente, si la horquilla de replicación en una hebra principal encuentra una lesión estancada, ADN polimerasa y primasa, PRIMPOL puede reprimir la síntesis aguas abajo, dejando una brecha de ssDNA detrás de13,14.
Evidentemente, la mayoría de estos eventos ocurren cuando la maquinaria de replicación del ADN se enfrenta a lesiones genómicas o durante la reparación acoplada a la replicación, lo que sugiere que un mayor daño en el ADN conduce a un aumento de los niveles de ssDNA. Como muchos de estos eventos están asociados a la replicación, la formación de ssDNA es considerada el marcador de “estrés de replicación” en las células15,16.
Aquí, describimos un ensayo que se puede utilizar para cuantificar de manera confiable ssDNA en las células. La simplicidad, la reproducibilidad y los beneficios de costo de este enfoque lo hacen susceptible de ser utilizado para evaluar la respuesta de estrés de replicación en las células. Los estudios emergentes han revelado que el nivel de ssDNA también puede ser un predictor de respuestas a la quimioterapia, como los inhibidores de las enzimas PARP1/2, ATR y Wee1 quinasa 17,18,19,20,21. Estos inhibidores están siendo perseguidos en el régimen de tratamiento de varios HGSOCs22. Por lo tanto, este ensayo también puede ser una herramienta útil para predecir las respuestas quimioterapéuticas en las células de cáncer de ovario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se mencionó en el protocolo, es valioso incluir algunos controles experimentales para garantizar que el ensayo esté funcionando. Estos incluyen una muestra no tratada con IdU, así como una muestra no tratada con anticuerpos primarios. Ambos controles negativos deben producir células teñidas por DAPI pero que no contienen señal de IdU.
Según las condiciones experimentales y las líneas celulares utilizadas, se pueden necesitar diferentes diluciones de anticuerpos para obtener la mej…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PV cuenta con el apoyo de la subvención inaugural Pedal the Cause del Alvin J. Siteman Cancer Center a través de The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant del Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant de Mary Kay Ash Foundation y V-Foundation. NR cuenta con el apoyo de la subvención T32 de capacitación en biología celular y molecular de los NIH a la Universidad de Washington, St. Louis.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
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