一种高效的小鼠卫星细胞CUT&RUN分析方案（经FACS分离）

摘要

本文介绍了一种高效的荧光激活细胞分选（FACS）方案，用于分离小鼠肢体肌肉卫星细胞，适用于通过靶点切割和核酸酶释放技术（CUT&RUN）研究肌纤维中转录调控。

摘要

基因组范围分析在细胞数量较少的群体中面临重大限制，这在干细胞研究领域尤为突出。本文介绍了一种高效利用荧光激活细胞分选（FACS）技术从小鼠肢体肌肉组织中分离卫星细胞的实验方案，该组织富含结构蛋白。成年小鼠的肢体肌肉经解剖后，在添加了dispase和I型胶原酶的培养基中通过机械剪切进行破碎处理。消化完成后， 将匀浆液通过细胞滤网过滤，细胞重悬于FACS缓冲液中。使用可固定活力染料测定细胞活力，并通过FACS分离免疫染色的卫星细胞。细胞用Triton X-100裂解，释放的细胞核与刀豆球蛋白A磁珠结合。细胞核/磁珠复合物与针对目标转录因子或组蛋白修饰的抗体孵育。洗涤后，细胞核/磁珠复合物与蛋白A-微球菌核酸酶孵育，并加入CaCl₂启动染色质切割。₂DNA提取后，构建文库并进行测序，通过生物信息学分析获得全基因组范围内转录因子结合及共价组蛋白修饰的图谱。不同组蛋白标记所获得的峰信号显示，这些结合事件特异性地发生在卫星细胞中。此外，已知基序分析揭示该转录因子与染色质发生结合。 通过 其对应的反应元件。因此，本方案适用于研究成年小鼠肢体肌肉卫星细胞中的基因调控。

引言

骨骼横纹肌平均占人体总重量的40%¹。肌纤维在受到损伤后表现出显著的再生能力，这一过程表现为新形成的成肌细胞融合并生成新的肌纤维，以替代受损的肌纤维²。1961年，Alexander Mauro 报道了一类单核细胞群体，并将其命名为卫星细胞³。这些干细胞表达配对盒转录因子7（PAX7），位于肌纤维的基底膜与肌膜之间⁴。据报道，它们还表达分化簇34（CD34；一种造血、内皮祖细胞和间充质干细胞标志物）、整合素α7（ITGA7；一种平滑肌、心肌和骨骼肌标志物）以及C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4；一种淋巴细胞、造血细胞和卫星细胞标志物）⁵。在基础状态下，卫星细胞存在于特定的微环境中，使其保持静息状态⁶。当肌肉受损时，它们被激活，开始增殖并进行成肌分化⁷。然而，由于卫星细胞仅占肌肉细胞总数的一小部分，其全基因组分析尤为困难，尤其是在生理条件下（<总细胞数的1%）。

已有多种用于从卫星细胞中分离染色质的方法被报道，这些方法包括染色质免疫沉淀联合大规模并行测序（ChIP-seq）或靶点切割与标签化（CUT&Tag）实验。然而，这两种技....

方案

小鼠饲养于经认证的动物房中，符合国家动物护理指南（欧洲委员会指令86/609/CEE；法国法令第87-848号）关于实验动物用于科研的规定。所有计划的操作均已提交至伦理委员会（Com'Eth，法国斯特拉斯堡）及法国研究部（MESR），根据2010/63/EU指令，在APAFIS编号#22281下进行伦理评估并获得许可。

1. 通过荧光激活细胞分选（FACS）分离卫星细胞的细胞悬液制备（图1）

1. 肌肉组织的分离
   1. 使用清洁剂（表1）对用于肌肉解剖的工具（包括镊子、手术刀和剪刀）进行去污处理，并用蒸馏水彻底冲洗。
   2. 准备两个2 mL离心管（表1），每管加入1 mL肌肉分离缓冲液，并置于冰上用于收集收获的肌肉组织。
   3. 通过CO₂窒息法处死两只10周龄的C57/Bl6J雄性小鼠，随后进行颈椎脱位。用70%乙醇喷洒每只小鼠全身。用镊子剥离后肢皮肤。解剖出股骨、胫骨和腓骨周围的所有四肢肌肉（每只小鼠约1 mg肌肉组织）。
      注意：卫星细胞数量在15周龄后逐渐减少。
   4. 将收获的四肢肌肉组织放入步骤1.1.2中准备的含1 mL肌肉分离缓冲液的2 mL离心管中。用....

结果

通过结合Gunther等人的方案（以下称为方案1）¹² 和Liu等人的方案²³（以下称为方案2），从小鼠骨骼肌中分离出卫星细胞。在使用方案1中推荐的胶原酶和分散酶浓度进行消化后，观察到存在未完全消化的肌纤维，因此按照步骤1.2.1和1.2.3所述，增加了酶的用量以改善肌纤维的解离效果。根据方案2的建议，将样品置于水浴中进行轻柔振荡，以维持细胞活力。我们按照方案1所述，使用细胞筛网进行过滤，并用红细胞裂解缓冲液进行孵育（见步骤1.2.7至1.2.10）。在方案1中，细胞被加载到30%/70%的Percoll密度梯度中，以分离位于界面处的单核细胞，但该步骤可能导致目标细胞的丢失。因此，参照方案2的建议，省略了此步骤。

通过FSC-A与SSC-A设门来根据细胞大小（FSC）和颗粒度（SSC）鉴定单核细胞（图3A）。通过排除FSC-A轴上低于40 K的事件去除碎片，共选出38.8% ± 3.6%的细胞。使用FSC-A与前向散射高度（FS.......

讨论

本研究报道了一种标准化、可靠且易于操作的小鼠卫星细胞分离与培养方法，以及利用CUT&RUN方法评估转录调控的实验方案。

本方案包含多个关键步骤。首先是肌肉组织的破碎和肌纤维的消化，以确保获得大量细胞。尽管酶浓度有所增加，但获得的活细胞数量仍多于使用方案1时的结果。卫星细胞表达一系列特定的膜蛋白。为了提高分选的严谨性，我们联合使用了先前报道的阴性（CD31、TER119、CD45和CD11b）和阳性（CD34、ITGA7和CXCR4）卫星细胞标志物^30,31。采用该策略，平均可获得约1%的活体候选卫星细胞。该结果处于预期范围内，因为在成年小鼠中，卫星细胞约占肌肉细胞群体的2%–7%³²。作为卫星细胞分选标志物的对照，我们分离了CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞。免疫荧光染色显示，CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞不表达PAX7，而70%的CD34+/ITGA7+/CXCR4+分选细胞对该卫星细胞特异性标志.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	2080422
2 mL 微量离心管	Star Lab	S1620-2700
5 mL 离心管	CORNING-FALCON	352063
50 mL 离心管	Falcon	352098
抗 AR 抗体	abcam	ab108341
抗 CD11b 抗体	eBioscience	25-0112-82
抗 CD31 抗体	eBioscience	12-0311-82
抗 CD34 抗体	eBioscience	48-0341-82
抗 CD45 抗体	eBioscience	12-0451-83
抗 CXCR4 抗体	eBioscience	17-9991-82
抗 DMD 抗体	abcam	ab15277
抗 H3K27ac 抗体	Active Motif	39133
抗 H3K4me2 抗体	Active Motif	39141
抗 ITGA7 抗体	MBL	k0046-4
抗 PAX7 抗体	DSHB	AB_528428
抗 TER119 抗体	BD Pharmingen TM	553673
磁珠	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus 刀豆蛋白 A
100 µm 细胞筛	Corning®	431752
40 µm 细胞筛	Corning®	431750
70 µm 细胞筛	Corning®	431751
离心机 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
离心机 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
腔室载玻片系统	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ 腔室载玻片
清洁剂	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
胶原酶 I 型	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
中性蛋白酶	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 磁铁	Invitrogen	12321D
可固定的活力染料	BD Biosciences	565388
流式细胞仪	BD FACSAria™ Fusion 流式细胞仪	23-14816-01
含 DAPI 的 Fluoromount G 封片剂	Invitrogen	00-4959-52
基因组浏览器	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
甘油	Sigma-Aldrich	G9012
水凝胶	Corning®	354277	Matrigel hESC 认证基质
图像处理软件	Image J®		V 1.8.0
实验室封口膜	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
没食子酸丙酯	Sigma-Aldrich	2370
测序仪	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
摇床水浴箱	Bioblock Scientific polytest 20	18724