mRNA 富集及亚硫酸氢盐处理mRNA文库构建用于高通量测序

摘要

本方案提供了一套易于遵循的工作流程，用于对目标生物样本进行多聚腺苷酸化RNA纯化、亚硫酸氢盐转化以及文库制备，且可使用标准化设备完成。

摘要

多种RNA转录本中的转录后修饰与真核细胞中多样的RNA调控相关。异常的RNA 5-甲基胞嘧啶修饰以及RNA甲基转移酶表达失调已被证实与多种疾病（包括癌症）相关。为在单碱基分辨率下鉴定经亚硫酸氢盐转化的RNA中胞嘧啶甲基化位点及其定量水平，已开发出全转录组亚硫酸氢盐测序技术。本文所述实验方案详细介绍了两轮poly(A) RNA纯化、三轮亚硫酸氢盐反应及文库构建的具体步骤，以实现mRNA 5-甲基胞嘧啶修饰位点的全转录组定位。在主要反应步骤后对RNA数量和质量进行评估，对于监测RNA完整性并确保获得高质量测序文库至关重要。理想情况下，整个流程可在三天内完成。采用本方案，以高质量的总RNA为起始材料，可高效构建适用于高通量测序的亚硫酸氢盐处理mRNA文库。

引言

在150多种转录后修饰中¹，5-甲基胞嘧啶（m⁵C）修饰已被发现存在于多种RNA类型中，包括核糖体RNA、转运RNA、信使RNA、微小RNA、长链非编码RNA、vault RNA、增强子RNA以及小 Cajal 体特异性RNA²。RNA上的m⁵C修饰与多种生物学和病理学机制相关，例如调控植物根系发育³、病毒基因表达⁴以及癌症进展⁵。本实验方案旨在提供简化的流程，用于表征不同发育阶段或疾病状态下生物样本中全转录组mRNA的m⁵C修饰谱。全转录组亚硫酸氢盐测序技术已被开发用于在单碱基分辨率下鉴定亚硫酸氢盐转化RNA中胞嘧啶的甲基化位点及其定量水平^6,7,8,9。该方法在研究m⁵C与基因表达及RNA命运之间的关联时尤为有用，有助于揭示细胞内参与生物学调控机制的潜在规律。在哺乳动物细胞中，目前已知有两种m⁵C识别蛋白：ALYREF可在细胞核内....

方案

1. 多聚(A) RNA 纯化

注意：使用经 DNase I 处理的总 RNA，并在进行 poly(A) RNA 纯化前，通过毛细管电泳或常规凝胶电泳评估总 RNA 的质量和完整性。研究者应能够在电泳图的高分子量区域观察到 28S 和 18S rRNA 核糖体条带，在低分子量区域观察到 5.8S rRNA 条带，且电泳图中无明显拖尾条带。纯化步骤基本遵循制造商说明书，仅在特定步骤中进行了微小修改。有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 准备
   1. 在进行以下操作前，将试剂、洗涤缓冲液、寡聚(dT)磁珠和裂解缓冲液在室温下预热30分钟。
   2. 为分离富集poly(A)的RNA，取适量高质量总RNA转移至无核酸酶的1.5 mL微量离心管中，作为起始材料，总量为10–20 µg。在热循环仪中于70 °C孵育5 min，随后冰上放置2 min。
      注：起始总RNA的用量应根据所需mRNA量及所用细胞类型适当调整。经验表明，poly(A)富集RNA在总RNA中约占1–5%。10 µg高质量总RNA通常可获得100–500 ng范围内的高质量poly(A)富集RNA，适用于后续亚硫酸氢盐转化。
   3. 同时，充分重悬寡聚(dT)磁珠。将所需体积的....

结果

根据本报告中的实验流程，从细胞系中生成了一系列bsRNA-seq文库¹⁹ (图1)。在对细胞系样本进行总RNA纯化并同时进行DNase处理后，通过凝胶电泳和紫外-可见分光光度法（A260/A280）检测RNA质量，随后可进行poly(A) RNA富集。为了评估两次纯化是否能够有效去除大部分核糖体RNA，采用毛细管电泳总RNA检测法对poly(A) RNA的纯化效率进行了分析，该方法可自动计算rRNA污染百分比 (图2)。根据RNA片段峰型图谱及rRNA污染百分比结果可见，在AsPC-1和BxPC-3细胞系中，经过两次纯化的RNA样本的核糖体RNA污染率分别从6.5%降至2.2%，以及从2.6%降至1.1%。在人胰腺癌细胞系中，经过两轮磁珠纯化后，poly(A)富集RNA占总RNA的平均丰度达到2.8 ± 1%。因此，采用寡聚(dT)磁珠结合两次纯化步骤进行poly(A) RNA富集，可显著降低核糖体RNA.......

讨论

本方案中，通过使用标准化组分，实现了多聚(A)富集、亚硫酸氢盐转化及文库构建的详细流程。进一步的测序分析可鉴定目标样本中的mRNA 5-甲基胞嘧啶。

关键步骤在于起始材料——总RNA的质量，因为RNA的降解会影响poly(A) RNA纯化的回收率。在进行poly(A) RNA纯化步骤之前，应小心处理样品，并避免RNase污染。该实验流程的另一个关键环节是文库构建过程中PCR扩增的循环次数。循环次数的选择取决于用于文库构建的经亚硫酸氢盐处理的mRNA量，以及在PCR前步骤中采用单次片段筛选还是双重片段筛选。因此，针对特定样品，需通过预实验并利用毛细管电泳分析PCR产物的片段大小分布，以确定同一细胞系或组织的最佳PCR循环数。

在本实验方案中，采用两轮寡核苷酸(dT)磁珠纯化，以富集和纯化poly(A) RNA，并去除大部分核糖体RNA及其他RNA。此外，也可使用其他方法去除核糖体RNA并保留样本中的其他RNA类型，例如基于寡核苷酸的rRNA耗竭法²⁶。随后，可对其他RNA类型中存在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent 2100 电泳生物分析系统	Agilent, Santa Clara, CA		RNA 质量检测
AMpure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63881	纯化 DNA
Bioanalyzer DNA 高灵敏度检测试剂盒	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA 质量检测
Bioanalyzer RNA 6000 Pico 试剂盒	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA 质量检测
DiaMag02 - 磁力架	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	辅助文库构建
DiaMag1.5 - 磁力架	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	辅助 poly(A) RNA 纯化
Dynabeads mRNA DIRECT 纯化试剂盒	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA 纯化；洗涤缓冲液 1 和洗涤缓冲液 2
乙醇	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA 甲基化试剂盒	Zymo, Irvine, CA	R5002	亚硫酸氢盐处理
萤火虫荧光素酶 mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	内参对照序列
KAPA 文库定量试剂盒	Roche, Switzerland	KK4824	文库定量
Nanodrop 分光光度计	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		总 RNA 定量检测
NEBNext Illumina 多重引物（Index Primer Set1）	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	文库构建
NEBNext Ultra 定向 RNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina）	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	文库构建
无核酸酶水	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 移液器	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 荧光计	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA 定量检测
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA 定量检测
Qubit RNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA 定量检测