本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析
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本文内容
摘要
摘要
淋巴系统参与免疫监视、脂质吸收以及组织液平衡的调节。小鼠淋巴管内皮细胞的分离是淋巴系统研究中的重要步骤，因为它能够实现后续的 体外 以及对分离细胞进行的生化实验。此外，Cre-lox 技术的发展使得针对无法进行全身性靶向的基因实现组织特异性缺失成为可能，从而精确确定这些基因在所研究组织中的作用。要解析特定基因在淋巴系统生理学和病理生理学中的功能，需要使用淋巴系统特异性启动子，因此必须通过实验验证靶基因的表达水平。
从野生型或转基因小鼠中高效分离淋巴管内皮细胞的方法，使得能够利用离体（ex vivo）和体外（in vitro）实验体系来研究调控淋巴系统功能的机制，并检测目标蛋白的表达水平。我们已开发、标准化并提出了一种基于LYVE-1表达，通过磁珠分选技术高效分离小鼠皮肤来源的淋巴管内皮细胞（DLECs）的实验方案。该方案旨在为研究人员提供一种实用工具，以进一步理解并阐明淋巴管内皮细胞功能中的关键作用分子，尤其适用于缺乏荧光激活细胞分选设备的研究机构。
引言
淋巴系统在人体生理学中发挥着关键作用。它被视为一种重要的稳态调节因子，参与维持组织-血浆液体平衡、免疫监视以及脂质吸收等重要功能1，同时也涉及一些新近发现的功能，例如心脏的修复能力2以及骨骼再生和造血功能3。尽管淋巴系统具有重要作用，但其在某些生理参数和反应中的具体作用及其调控的分子机制仍不明确。此外，淋巴管系统的结构或功能缺陷是某些病理生理状况的诱发或恶化因素。典型的例子包括原发性和继发性淋巴水肿，分别取决于疾病的遗传性或非遗传性病因；而淋巴系统在原发性肿瘤生长及转移扩散中的作用尤为关键，因其既可作为转移的通道，也可调节免疫功能1。
与血管系统相比，淋巴系统在研究和认知上的滞后，主要归因于淋巴系统的发现时间晚于血液循环系统，以及特异性淋巴分子标志物的鉴定存在延迟。近几十年来，这一状况已得到显著改善，从而改变了人们对稳态及疾病状态下淋巴系统的传统认知1。与血管生成类似，淋巴管生成是指由已有淋巴管形成新淋巴管的过程，在多种疾病的发生发展中发挥关键作用4,5,6
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方案
动物实验根据德克萨斯理工大学健康科学中心（TTUHSC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案在TTUHSC进行，以及根据第2010/63号指令由西希腊州兽医管理局批准的方案在帕特雷大学进行。处理动物废弃物时，应严格遵守废弃物处置规定。
1. 小鼠真皮组织的分离
- 第1天
注意：第1天；准备好以下材料和设备：麻醉室、动物毛发剪刀、异氟烷、精细镊子、0.2 µm注射器滤器。- 在DMEM中配制含1×抗生素-抗真菌溶液的2 mg/mL Dispase溶液，并进行过滤除菌。
注意：可使用HBSS替代培养基或PBS，因其已在其他报道中成功应用 实验方案121x 抗生素-抗真菌素溶液可用青霉素（100 I.U./mL）、链霉素（100 µg/mL）和两性霉素（2.5 µg/mL）替代。 - 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉（异氟烷浓度：0.5–2%，气流速度：1 L/min）。待小鼠停止活动后，将其移出笼具，通过鼻罩继续维持麻醉，异氟烷气流速度保持相近。通过夹趾反应检测以确认麻醉深度，并持续监测小鼠状态，确保维持深度麻醉（无运动反应）。剪除约9 cm2 沿中线使用毛发修剪器纵向剃除小鼠背部和腹部的背侧与腹侧毛发。让小鼠从麻醉中恢复后放回笼中。
注意：可改用脱....
- 在DMEM中配制含1×抗生素-抗真菌溶液的2 mg/mL Dispase溶液，并进行过滤除菌。
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结果
该方法旨在鉴定一种小GTP酶RhoA的蛋白表达，其编码基因在两个等位基因上均被floxed，并在他莫昔芬诱导的淋巴内皮特异性启动子Prox1-CreERT2 18作用下被删除。分离得到的LEC最多可培养至第四代，之后细胞进入衰老状态。这些细胞已被成功冻存、复苏，并用血管生成素-2进行有效刺激。由于细胞传代次数有限，我们未尝试多次冻融循环。从小鼠分离一次所获得的典型细胞产量可使60 mm培养皿达到40–50%的融合度（约1.5 × 106个细胞），且细胞增殖缓慢，在进行基于LYVE-1的纯化时，培养皿需5天才达到完全融合。
首次纯化后，LYVE-1+ 细胞在 60 mm 培养皿中的汇合度约为 15%（约 4 × 105 个细胞）。第二次纯化为可选步骤，本文所提供的数据和图像均基于仅进行一轮纯化的结果。存在一些未被筛选出的细胞，这些细胞携带磁珠，似乎所结合的磁珠数量不足以实现有效筛选。如前所述，建议在使用 dispase 消化的同时并行添加 DNAse，尽.......
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讨论
淋巴系统是机体稳态功能的重要调节者，其最重要的功能包括维持血浆液体平衡、清除细胞代谢产物和有毒分子、脂质吸收以及免疫细胞的迁移1,19。特异性标志物的发现推动了淋巴系统研究领域新数据的大量涌现，揭示了淋巴脉管系统的一些新功能，例如其在某些器官修复和再生能力中的作用2,3。随着对淋巴系统认知的不断深入，其在多种病理状态中的作用日益明确，改变了以往对该系统的传统认识1。淋巴系统在多种疾病的进展中发挥着重要作用，例如癌症的生长与转移20、米尔罗伊病（一种原发性淋巴水肿）21,22，以及卡波西样淋巴管瘤病，后者是一种以淋巴管扩张和相互连接为特征的罕见疾病23
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由希腊研究与创新基金会（00376）、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）、美国国家癌症研究所（NCI）[资助号 R15CA231339]、德克萨斯理工大学健康科学中心（TTUHSC）药学院科学事务办公室拨款（授予 C.M.M.）、路易斯安那门罗大学药学院启动资金、美国国立卫生研究院（NIH）通过国家普通医学科学研究所[资助号 P20 GM103424-21]以及路易斯安那州立大学理事会研究竞争力子项目（RCS）通过理事会支持基金（LEQSF(2021-24)-RD-A-23）（授予 G.M.）资助。共同使用的TTUHSC设备由德克萨斯癌症预防研究所（CPRIT）资助项目RP190524和RP200572提供。资助方未参与研究设计、撰写决定或稿件准备。图 1A 中的图形摘要由 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 注射器滤器 | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 100 mm 组织培养皿 | Fisher Scientific | FB012924 | |
| 60 mm 组织培养皿 | Fisher Scientific | FB012921 | |
| 动物毛发剪毛器 | Wahl | ||
| 抗生素-抗真菌素溶液 100x | Fisher Scientific | 15240-062 | |
| 钝头镊子 | Fine Science Tools | 11992-20 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| 细胞滤网 40 μm | Fisher Scientific | 542040 | |
| 细胞滤网 70 μm | Fisher Scientific | 542070 | |
| CO2 培养箱 | |||
| I型胶原蛋白，高浓度大鼠尾部来源 | 康宁 | 354249 | 用 H₂O 将 0.02 M 乙酸稀释2O |
| II型胶原酶 | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11-995-073 | |
| DNA酶I溶液（2,500 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 90083 | |
| Dynal MPC-L 磁性颗粒浓缩仪 | Invitrogen | 120-21D | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | |
| 内皮细胞生长基础培养基 &和补充剂（LEC 培养基） | R&D Systems | CCM027 | |
| 安乐死舱 | Euthanex Corporation | ||
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| 精细剪刀-锋利 | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| FITC 标记的抗小鼠 F4/80 抗体 | Biolegend | 123107 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG 磁珠 | New England Biolabs | S1432S | |
| LARC-A E-Z 麻醉诱导室 | Euthanex Corporation | ||
| MagnaBind 山羊抗兔 IgG 珠 | 赛默飞世尔科技 | 21356 | |
| 4% PBS 甲醛溶液 | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| 兔抗小鼠LYVE-1抗体 | ReliaTech GmbH | 103-PA50 | |
| 旋转/振荡培养箱 | |||
| 圆底聚丙烯管 | 康宁 | 352063 | |
| 带 0.2 微米滤膜的注射器滤器 μ微孔 | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Fisher Scientific | 25-300-120 |
参考文献
- Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
- Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair....
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重印与许可
