方法文章

利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

DOI：

10.3791/65430

⸱

2023年8月25日

 ,  ,  ,  , 
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

本文内容

摘要

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我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，通过基因组分析和功能基因组筛选，鉴定并比较在基因工程小鼠模型中以及相应人类肿瘤类型中发生的肿瘤的治疗靶点。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）起源于施万细胞或其前体细胞。在患有肿瘤易感综合征——1型神经纤维瘤病（NF1）的患者中，MPNSTs是最常见的恶性肿瘤，也是导致死亡的主要原因。这类罕见且具有高度侵袭性的软组织肉瘤预后极差，5年无病生存率仅为34%–60%。目前针对MPNSTs患者的治疗手段非常有限，主要治疗方式仍为致残性手术。许多曾被寄予厚望的疗法在临床试验中均告失败，例如Ras信号通路抑制剂替吡法尼（tipifarnib）。同样，以厄洛替尼（erlotinib，靶向表皮生长因子受体EFGR）和索拉非尼（sorafenib，靶向血管内皮生长因子受体VEGF、血小板源性生长因子受体PDGF及Raf）联合标准化疗方案进行的II期临床试验，也未能在患者中产生有效应答。

近年来，功能基因组筛选方法与肿瘤细胞系的遗传谱型分析相结合，已被证明在识别关键的胞质信号通路以及开发靶向特异性治疗策略方面具有重要价值。对于罕见肿瘤类型，一种被称为跨物种比较肿瘤基因组学的方法正被 increasingly 用于发现新的治疗靶点。在跨物种比较肿瘤基因组学中，首先在基因工程小鼠（GEM）模型中进行遗传谱型分析和功能基因组学研究，然后在可获得的罕见人类样本和细胞系中验证结果。

本文介绍了如何利用全外显子组测序（WES）在人和小鼠恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中识别候选驱动基因突变。随后，我们描述了如何开展全基因组规模的短发夹RNA（shRNA）筛选，以鉴定并比较小鼠与人MPNST细胞中的关键信号通路，并识别这些通路中可作为药物靶点的分子。这些方法为在多种人类癌症类型中发现新的治疗靶点提供了有效途径。

引言

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恶性外周神经鞘瘤（MPNSTs）是一种高度侵袭性的梭形细胞肿瘤，可发生于与肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病（NF1）相关的患者中，也可在普通人群中散发出现，或出现在既往接受过放射治疗的部位。1,2,3NF1 患者出生时携带一个野生型的拷贝 NF1 肿瘤抑制基因和第二个 NF1 等位基因发生功能缺失突变。这种单倍体不足状态使NF1患者易在其野生型等位基因上发生第二次功能缺失突变 NF1 基因，可触发肿瘤发生。当该 "二次打击" NF1 当施万细胞谱系中的细胞发生突变时，会形成两种肿瘤：一种是起源于皮肤的皮肤型神经纤维瘤，另一种是发生在大神经或神经丛的丛状神经纤维瘤。尽管皮肤型神经纤维瘤与丛状神经纤维瘤的病理特征相同，但它们的生物学行为却显著不同——虽然两者均为良性肿瘤，但只有丛状神经纤维瘤可能发生恶性转化并发展为恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）。除了神经纤维瘤蛋白的缺失外，还包括由Ras GTPase激活蛋白编码的基因的失活 NF1 基因，MPNSTs 携带多个其他肿瘤抑制基因的突变，包括 TP534,5,6,7CDKN2A8,9, 和 PTEN10, 编码组分的基因突变 多梳抑制复合物211,12 PRC2；该 SUZ12 和 EED 基因）和受体酪氨酸激酶的异常表达1,2. 突变 NF1 上述其他基因在散发性和辐射诱导的恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）中同样存在11,12.

尽管这些关于 MPNST 基因组异常的研究进展对于理解其发病机制具有重要价值，但它们尚未推动 MPNST 新疗法的有效开发。阻碍新疗法研发的一个主要障碍在于 MPNST 是一种罕见癌症。正因如此，很难获得足够数量的患者样本，以开展诸如癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）所进行的全局性分析，用以确定关键的驱动突变。根据我们的经验，即使积累数量有限的人类 MPNST 标本也可能需要数年时间。为了克服这些限制，许多研究其他罕见癌症类型的研究人员已转向跨物种比较肿瘤基因组学方法，以鉴定关键的驱动基因突变，明确特定肿瘤中必需的胞质信号通路，并发现新的治疗靶点。由于对肿瘤发生至关重要的信号通路在人类与其他脊椎动物物种之间高度保守，因此采用功能基因组学方法（如全基因组规模的 shRNA 筛选）可能是识别这些新的驱动突变、信号通路和治疗靶点的有效手段13,14,15,16,17,18,19，尤其是在研究样本数量极为有限的罕见人类肿瘤类型时尤为有效20。

在本文所述的方法中，我们介绍了在人类恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞系及源自P的早期传代MPNST培养物中进行基因组谱型分析的这一方法0-GGFβ3 小鼠，一种基因工程小鼠模型（GEM），其施万细胞特异性过表达生长因子神经调节蛋白-1（NRG1），可促进丛状神经纤维瘤的发生及其向恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的进展21,22,23该方法的第一步是识别P中的候选驱动基因0-GGFβ3 MPNSTs、人类MPNST细胞系以及手术切除的人类MPNST组织。为了在功能上验证这些突变所影响的信号通路，我们随后利用全基因组规模的shRNA筛选，鉴定在人类和小鼠MPNST细胞系中增殖与存活所必需的基因。在确定了增殖与存活所必需的基因后，我们进一步从这些基因集合中鉴定出具有药物靶向潜力的基因产物 "命中数" 使用药物基因相互作用数据库。我们还比较了 "命中数" 在人和小鼠的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中，确定GEM模型与人类MPNST是否表现出对相同基因和信号通路的相似依赖性。识别在增殖和存活过程中所需基因以及受影响的信号通路中的重叠部分，可作为验证P的手段0在分子水平上研究GGFβ3小鼠模型。该方法还强调了结合人类与小鼠筛选以发现新治疗靶点的有效性，其中小鼠模型可作为人类筛选的补充。这种跨物种方法在寻找罕见肿瘤的治疗靶点时尤为有价值，因为在这些情况下，人类肿瘤组织和细胞系难以获得。

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方案

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在开展研究之前，动物实验操作及病毒载体处理方案须提交机构动物照护与使用委员会（IACUC）和机构生物安全委员会（IBC）审查并获得批准。本文所述操作已获南卡罗来纳医科大学（Medical University of South Carolina）IACUC和IBC的批准，并由经过适当培训的人员依照《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》及南卡罗来纳医科大学的机构动物照护指南执行。

1. WES-Seq 分析与致病性变异的鉴定

  1. 从肿瘤样本或在60 mm培养皿上生长至70%融合度的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中提取基因组DNA，采用标准的市售基于硅胶吸附法（参照试剂盒生产商提供的操作说明进行具体步骤）。常规操作流程如图所示 图1.
  2. 除非另有说明，向测序核心实验室提交的基因组DNA样本应不少于10 µL，浓度为50 ng/µL。
    1. 核心设施通过超声处理将基因组DNA打断，随后采用首选方法进行纯化。使用选定的外显子组测序试剂盒进行外显子捕获和文库构建，并在外显子扩增产物上添加索引标签。
    2. 将样本提交至测序中心进行全外显子组双端测序（WES；每端测序100 bp）。
    3. 核心实验室生成的FASTQ文件将提供给研究人员。仅使用通过质量评估指标的FASTQ文件进行分析。
  3. 使用商业软件程序（如 DNAStar19,20、Partek21 或 Varsome）对 FASTQ 文件进行比对和分析。采用默认设置将 FASTQ 文件比对至小鼠参考基因组 GRCm38/mm10。
    注意：以 DNAStar 和小鼠 MPNST 样本为例，其一般工作流程如图所示 图1 并简要说明如下。
    1. 打开 DNAStar 软件，选择 SeqMan NGen 工作流程。
    2. 选择工作流程以进行选择 变异分析/重测序 测序分析的类型 基于NGS的扩增子、基因 panel 或外显子组. 点击 下一步.
    3. 选择首选的参考序列 下载基因组包 以及相应的参考基因组（例如 Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip 或 Homo sapiens-GRCh37.p13.zip）。如果核心设施提供了 bed 文件，请上传此辅助文件。点击 下一步.
    4. 选择测序技术以确定输入序列 Illumina，并指定该 测序读长 是 双端然后，选择实验设置中的多样本选项，并通过选择上传测序FASTQ文件 添加. 如果正在运行 多个样品，为每对末端测序数据集指定一个唯一的实验或样本名称 肿瘤，细胞系 或 A18, A202… 点击 下一步.
    5. 设置 对照数据集 如果存在。点击 下一步 并点击 下一步 再次在下方 组装选项. 在 分析选项，点击相应的 变异检测模式 作为 二倍体，然后点击 下一步. 在……之下 组装输出，命名并指定项目的文件保存位置；点击 下一步. 运行 在本地计算机或云端进行组装。
      注意：生成的比对文件可在 ArrayStar 检测到的单核苷酸多态性（SNPs）的变异注释工作流程。该工作流程用于检测SNPs，不适用于基因拷贝数的增加或减少。拷贝数变化需通过另一种称为高密度SNP芯片的分析方法进行检测；全外显子组测序无法可靠地检测拷贝数变化。有关与比对程序相关的具体操作步骤，请参考程序用户指南。
    6. 对检测到的SNP的变异注释应用用户自定义过滤器，以包含或排除特定数据。为了获得可能具有功能相关性的变异的精简列表，按以下层次对变异数据集应用如下过滤器： 不在对照组 （如果有正常对照样本） 群体频率 （gnomAD、ExAC、1,000基因组频率） 等位基因频率 （包括 ≤0.001 或 0.1%） 测序深度 （排除 <10 深度）， 致病性 或 ClinVar 分类 （包括：致病性、可能致病性；排除：意义未明、可能良性、良性），并根据需要 SNP类型与编码影响 （包括：非同义突变、错义突变、无义突变、移码突变、框内突变、剪接位点突变）
      注意：可将已知的相关癌症基因列表应用于最终列表，以筛选出特定的疾病相关基因，参见步骤 1.3.7。这些筛选条件可将变异基因列表缩减至少于 20 个基因。
      1. 使用变异等位基因频率来过滤测序错误引起的单核苷酸多态性（SNP）。对于纯度高且无污染的细胞群体（例如，已建立的肿瘤来源细胞系应代表单一的同基因型肿瘤细胞群体），纯合变异和杂合变异的频率分别约为100%和50%。在此情况下，应用 100-90% 和 50-40% 等位基因频率 作为筛选条件以滤除低于该阈值的所有变异。如果同一数据集还具有高密度 SNP 芯片数据，可应用 拷贝数增加 或 损失 到 等位基因变异频率低于纯合或杂合比例的SNP （即拷贝数增加导致等位基因A有2个拷贝，等位基因B有1个拷贝时，相应的变异等位基因频率分别为75%和25%）。
    7. 在使用 ArrayStar 鉴定出致病性变异后，将变异基因列表导出并保存为 csv、txt 或 xls 文件，并将携带这些突变的基因与 P 队列中的基因进行比较0-利用GGFβ3诱导的肿瘤确定重叠和独特的突变基因列表，并将这些突变基因与已知与其人类对应物相关的突变基因进行比较（例如Bushman实验室癌症基因列表或用户自定义的基因列表）。
      1. 可选步骤：在应用任何用户自定义过滤器（1.3.6）之前，将注释后的文件导出并保存为VCF文件。
        注意：该VCF文件可上传至其他变异效应预测软件（如Varsome或VEP）进行二次分析以供比较。也可对筛选后的变异基因列表进行生物学及通路分析。
    8. 通过用户首选的数据库对变异基因列表进行功能分类，以获取蛋白质类别、通路、通路组分、基因家族及本体信息。
      注：此处以 PANTHER (pantherdb.org) 为例。
      1. 上传带有基因 ID 的过滤后基因列表。
      2. 选择生物体（Mus musculus).
      3. 选择分析（在基因列表中查看功能分类）并点击 提交 对过滤后的变异基因列表进行生物学与通路分析。

2. 基因组规模的shRNA筛选

注意：已有多种可用于低代次肿瘤培养物全基因组功能筛选的shRNA和CRISPR文库。此处以CELLECTA DECIPHER shRNA文库为例进行说明。CELLECTA DECIPHER慢病毒shRNA文库经过优化，适用于混合格式的RNAi遗传筛选。每条转录本由至少5–6个独特的shRNA靶向，每个慢病毒shRNA载体均包含一个两侧带有PCR引物位点的独特遗传条形码。这些文库覆盖了大多数与人类和小鼠疾病相关的基因，但并未涵盖基因组中的全部基因。Cellecta人源文库质粒DNA分为三个模块（人源模块I、II、III；共靶向15,377个基因），小鼠文库质粒池则分为两个模块（小鼠模块I和II；共靶向9,145个基因）。这些文库可用于开展 "脱落" 在病毒转导后的不同时间点，对增殖和/或存活所必需的靶基因进行差异表达分析的检测方法。

  1. 慢病毒包装
    1. 第0天：在10个15 cm培养皿中分别接种1000万个293T细胞，每皿加入30 mL含10%胎牛血清（FBS）的无抗生素DMEM培养基。
    2. 第1天：确认细胞在次日融合度约为80%，已准备好进行转染。在50 mL锥形管中，按以下顺序混合：600 µL包装质粒混合物（0.5 µg/µL）、60 µL质粒条形码文库、12 mL DMEM（不含血清和抗生素）以及600 µL转染试剂。室温孵育15分钟。
    3. 将900 µL转染试剂与12 mL DMEM加入另一个15 mL离心管中，涡旋混匀。取12.9 mL转染试剂/DMEM混合液加入DNA混合物中，轻轻弹击混匀。室温孵育15分钟，期间不再混匀。将2.5 mL该混合液逐滴加入每皿15 cm的293T细胞培养皿中，于组织培养箱中过夜孵育。
    4. 第2天：次日更换培养基，使用含抗生素的常规生长培养基。
    5. 第3天：通过收集培养基并经0.2 µm滤器过滤，将病毒收获，并分装至15 mL锥形管中；同时将过滤后的病毒分装成五份，每份1 mL，置于冻存管中，用于病毒滴度测定（视为48小时病毒）；将病毒储存于-80 °C超低温冰箱中。逐个更换培养板中的培养基，每板加入30 mL新鲜生长培养基，以避免细胞干燥。
    6. 第4天：收集培养基，通过0.2 µm滤器过滤以收获病毒。将病毒分装至15 mL锥形管中。此为72小时病毒液；将病毒储存于-80 °C冰箱中。
  2. 滴定慢病毒文库
    1. 向65 mL肿瘤细胞生长培养基中加入65 µL阳离子聚合物（10 mg/mL）。将含聚合物的培养基用移液器加入11个6孔组织培养板中，每孔1 mL。用胰蛋白酶消化早期代次的肿瘤细胞，并采用常规方法计数，使每孔接种50,000个细胞/mL。从冰箱中取出48小时的慢病毒，每份1 mL，在37 °C水浴中解冻。
    2. 为每个病毒模块，按所示方式准备感染 表1.
    3. 将所有6孔板放入组织培养箱中。次日，移除病毒培养基，并补充新鲜生长培养基。48小时后，向所有需要筛选的孔中加入含嘌呤霉素的培养基。在对照细胞达到汇合之前，采用首选方法对存活的克隆进行细胞计数。
      注意：杀死非转导细胞所需的嘌呤霉素浓度必须通过在一定浓度范围内进行预实验，凭经验预先确定 "杀死" 曲线。使用能够均匀诱导未转导培养物死亡的最低浓度。
  3. 靶细胞的慢病毒感染
    1. 胰酶消化 MPNST 细胞并计数。每模块共接种二十个 15 cm 培养皿，每皿接种 250 万个细胞。解冻病毒，并在每毫升含 5 µg 阳离子聚合物的条件下，以 0.5 的感染复数（MOI）用病毒转导细胞。图2A).
    2. 次日早晨移除含病毒的培养基，更换为新鲜的生长培养基。继续培养细胞2天，以允许筛选标记的表达，随后向培养物中加入嘌呤霉素，以清除未转导的细胞。
    3. 加入嘌呤霉素三天后，用胰蛋白酶消化细胞，并将一半细胞悬液在台式离心机中以200 × g离心5分钟。将沉淀的细胞保存于-80 °C冰箱中，用于后续基因组DNA提取；此为参考时间点，即时间点1（T1).
    4. 将另一半细胞群体重新接种，并培养至大约经过7次群体倍增，然后按照上述方法收集并离心。该细胞沉淀将作为最终时间点（时间点2）。 T2）并储存于 -80 °C，用于后续基因组 DNA 提取（图2).
  4. 从病毒感染池转导的细胞中分离基因组DNA
    1. 从-80 °C冰箱中取出细胞沉淀，将其重悬于10 mL含有RNA酶的重悬缓冲液中，立即分装至两个15 mL聚甲基戊烯管中（图2B).
    2. 每5 mL加入500 µL 10% SDS，混匀，室温孵育5分钟。随后将离心管放入DNA剪切仪中，在4 °C条件下进行超声处理，设置25个循环，每个循环为30秒开启、30秒关闭。
    3. 加入5 mL酚/氯仿（pH 8.0，4 °C保存），使用前务必充分混匀酚/氯仿。加入酚/氯仿后，在最大转速下剧烈涡旋振荡45–60秒，充分混匀。于-20 °C、7,200 × g离心60分钟。 g.
      注意：涡旋振荡后若出现泡沫状/乳状外观，表明已完全重悬。
    4. 将3 mL澄清的上层相转移至一个新的15 mL离心管中，加入0.5 mL 3 M乙酸钠和4 mL异丙醇，充分混匀（图2C）。在 20 °C 下以 7,200 × g 离心 30 分钟 g.
    5. 离心后，弃去上清液，然后小心吸除残留液体。加入0.5 mL 70%乙醇，通过上下吹打使沉淀重悬。将重悬的沉淀转移至1.5 mL离心管中，并将同一样本的两个沉淀合并至同一个1.5 mL离心管内。在台式离心机中以最大速度离心5分钟。
    6. 弃去上清液，用实验室擦拭纸吸除残留的70%乙醇。将沉淀重悬于0.5 mL蒸馏水中，注意避免沉淀干燥，否则将难以重悬。在测定DNA浓度前，将样品储存于4 °C。
  5. 嵌套PCR扩增shRNA条形码
    注意：从储存中取出 DNA 并置于冰上。如果 DNA 浓度低于 100 ng/µL，则使用真空浓缩仪干燥 DNA，并用适量的蒸馏水重新溶解。我们建议每次仅处理一个模块（时间点 1）T1）或时间点2（T2)). 每个时间点进行两次制备，最终合并处理；因此，重要的是不要在同一天处理同一批次的重复时间点。以下方案适用于一个时间点的基因组DNA制备。
    1. 准备7个试管，并按如下标注：阴性对照、阳性对照、4个基因组DNA样本管和1个主混合液管图3A阴性对照为蒸馏水；阳性对照为在293T细胞转染中用于产生慢病毒的质粒DNA。
    2. 先按照指示向每支试管中加入水 表 2.
    3. 按照所示方法配制主混合液（MM） 表3.
    4. 向每支含有水的试管中加入 18 µL MM。接着，向 4 支模板管中每管加入 25 µL 基因组 DNA。然后，向阳性对照管中加入 1 µL 阳性对照（10 ng/µL），注意避免阳性对照 DNA 污染其他试管。最后，向每支试管中加入 2 µL 聚合酶，先加入 4 支样本管，最后加入阳性对照管；混匀后离心收集 PCR 管中的液体。图3).
    5. 在指定条件下进行PCR反应 表4.
    6. 在第一轮 PCR 运行的同时，准备第二轮 PCR 所需的管子nd PCR，如所指出的 表5. 设置七个试管：阴性对照、阳性对照、4 个用于基因组 DNA 的试管，以及 1 个用于 MM 的试管图3B).
    7. 向每支含有水的试管中加入 22 µL MM，并在添加 DNA 和聚合酶之前，等待第一轮 PCR 结束。
      1. 第一轮PCR完成后，将4个样本管合并至一个微量离心管中并混匀。
      2. 向每个含有水的样品管中加入 25 µL。
      3. 接下来，向适当标记的试管中分别加入2 µL第一轮PCR阴性对照和2 µL第一轮PCR阳性对照。
      4. 向每支试管中加入2 µL聚合酶，先加4个样本管，最后加阴性对照管。
    8. 按照所述进行PCR反应 表6.
      注意：在3.5%琼脂糖凝胶上通过电泳分析第一次PCR反应结果时，若产物量较多，可将后续重复实验的循环次数减少至9–10次；反之，若产物量较低，可将循环次数增加至14次。
    9. 当第二次PCR反应完成后，将4个样品合并至一个微量离心管中，并加入80 µL的6x上样缓冲液。对于阳性和阴性对照，使用20 µL样品。
      1. 在 Tris-硼酸-EDTA (TBE) 缓冲液中配制 3.5% 琼脂糖凝胶（图4A）。为容纳较大的样品体积，可用胶带将梳子中的多个孔连接起来形成一个大孔（若无适合体积的梳子），但需确保留出两个孔用于阳性对照和阴性对照。以90 V电压电泳运行1小时。
    10. 观察凝胶，确认在约250个碱基对（bp）处有一条条带。
  6. 第一次纯化：凝胶回收
    1. 使用洁净的手术刀或剃须刀片切下250 bp条带，尽可能去除多余的凝胶。将较大的条带切成4份，分别转移至洁净的微量离心管中。称量并记录每份凝胶切片的重量。
      注意：每管组织块应不超过约 200 mg。
    2. 加入6倍体积的溶解缓冲液（例如，若凝胶块重200 mg，则加入1.2 mL缓冲液）。将试管置于50 °C水浴中，每10–15分钟轻轻旋转一次，直至凝胶切片完全溶解。随后，向每管中加入1倍体积的异丙醇（例如，若凝胶块重200 mg，则加入0.2 mL异丙醇）。
    3. 使用两个离心柱进行纯化，将全部4个管中的样品加入离心柱中。由于离心柱最大容量为750 µL，需多次离心以处理全部样品体积。以17,900 × g 在常规台式微量离心机中离心1分钟，每次离心后弃去滤过液。
    4. 用 750 µL 洗涤缓冲液洗涤柱子，并在 17,900 × g 1分钟。洗涤后，弃去滤液，通过在17,900 × g 孵育3分钟。每根柱子用50 µL蒸馏水洗脱DNA，按前述方法离心1分钟，合并两管洗脱液，共得100 µL样品。
  7. 第二次纯化
    1. 下一步纯化步骤将使用PCR纯化试剂盒中的结合缓冲液2（Binding Buffer 2），该缓冲液不能去除小片段。向100 µL DNA中加入400 µL缓冲液，然后将其加载到一个离心柱上（图4B). 在 17,900 × g 1 分钟。
    2. 接下来，用650 µL洗涤缓冲液洗涤膜，离心操作同前。将吸附柱额外离心3分钟以干燥，条件同上。
    3. 用30 µL蒸馏水洗脱DNA，并以最大速度离心1分钟。洗脱后，使用分光光度计检测浓度；确保浓度不低于10 ng/µL，且不高于70–80 ng/µL。将DNA储存于-20 °C冰箱中。
  8. 扩增条形码测序
    1. 测序时，使用洗脱缓冲液（EB）将纯化的条形码稀释至0.75 ng/µL。为增加测序多样性，将扩增产物在17 pM浓度下进行簇生成，并加入30%（v/v）PhiX。根据制造商说明书，在自动化簇生成系统上进行单端（SE）簇生成。
    2. 让测序中心在NextGen测序仪上进行总共36个循环的单端测序（图4C加入自定义引物 GexSeqS 至终浓度为 0.5 µM 的 Illumina 测序引物中。
    3. 使用参考分析软件生成 Fastq 文件，并利用软件将读长修剪至 18 个核苷酸。
    4. 使用条形码分析与解卷积软件对截短的测序读段进行解卷积。通过参考时间点（T1）与最终时间点（T2）的读段数之比，计算每条shRNA的耗竭倍数分数。
  9. shRNA筛选结果分析及候选治疗靶点鉴定
    注意：在Cellecta shRNA文库中，大多数基因由5种（67%）或6种（32%）不同的shRNA靶向。然而，一些管家基因（在大多数细胞中均应表现为阳性结果）被大量shRNA靶向，可作为对照，用于界定阴性评分的范围。
    1. 为防止对由较多shRNA靶向的基因产生偏差，对耗竭分数进行对数转换。通过计算每个基因经验分布的第80百分位数来进行分位数估计。
    2. 为生成对数倍数耗竭分数的零分布，假设 >95%的基因不会被耗尽，其log-quantile得分将呈正态分布。利用经验分布的中位数来估计零分布的均值。基于该零分布，将log-fold耗尽得分大于零分布第95百分位数的所有基因归类为“显著基因”（hits）。
      注意：所有命中结果应至少包含两个shRNA，其耗竭评分高于截断值（图5).
    3. 为评估RNAi剔除筛选数据的质量及截断点的有效性，可使用由COLT Cancer RNAi筛选计划定义的一组“核心必需”基因24,25 作为对照。从命中列表中移除看家基因（CEGs），以生成潜在治疗靶点的初步列表。
      注意：COLT 基因集中被判定为阳性结果的基因 >在通过COLT筛选的72种癌症细胞系中，有50%表现出核心必需基因。核心必需基因列表包含640个基因。
    4. 为了鉴定在多种恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞系中普遍存在或共同依赖的潜在治疗靶点，构建不同MPNST细胞系或早期传代培养物筛选中鉴定出的非CEG命中基因的维恩图图6A优先考虑在所有或大多数MPNST细胞系或培养物中必需的非CEG命中基因。
      1. 或者，对每种细胞系或早期传代培养物的非CEG命中基因列表进行通路分析，以鉴定其产物编码参与肿瘤细胞增殖和/或存活所必需的信号通路组分的基因。随后，将非CEG通路分析中鉴定出的信号通路与通过全外显子组测序（WES）鉴定出的突变所影响的信号通路进行比较。
        注意：我们发现，将全外显子组测序（WES）中鉴定出的突变所一致影响的信号通路，与shRNA筛选中确定为关键的信号通路进行比较，具有特别重要的意义。
    5. 利用药物基因相互作用数据库（dgidb.org），对剔除核心必需基因后剩余的候选基因列表进行筛选，以鉴定已有可用治疗药物的可成药靶点。
      注意：该数据库允许同时输入并筛选一组基因，并提供针对这些基因的现有药物的相关指导。
    6. 首先使用与初始文库筛选中所用不同的shRNA，在单个批次（而非上述文库批次）格式中敲低已鉴定出的具有高研究价值且可成药的靶基因表达，以验证这些靶点。为实现基因表达的敲低，使用2至3种不同的慢病毒shRNA。感染后3至4天，按以下所述评估其对肿瘤细胞增殖和存活的影响。

3. 对接受候选治疗药物处理的恶性周围神经鞘瘤细胞进行细胞数量和活力的流式细胞仪检测

  1. 将恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞在DMEM培养基中培养至80%融合度。用室温的Hanks'平衡盐溶液（HBSS）冲洗细胞。
    注意：不要将细胞培养至完全融合，因为这些细胞在重新接种后会暂时生长迟滞。
  2. 用非酶细胞解离液覆盖细胞30秒至1分钟，使细胞从基质上脱离。每1 mL解离液中加入5 mL DMEM，并轻轻吹打细胞，使其完全脱离基质。
  3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。以每孔1,200个细胞的密度将细胞接种于黑色壁的96孔板中；每种药物稀释浓度至少设置三个复孔，并对实验进行三次生物学重复。
  4. 为确定待测药物的初始浓度，需查阅文献以评估其对其他癌细胞类型有效的浓度范围。在初步实验中，测试的浓度范围应涵盖比其他癌细胞类型所用药物浓度高两个数量级至低两个数量级的区间。
  5. 配制待测药物的系列稀释液，并将每种稀释液或对照溶剂加入至少三个重复孔中。
  6. 在加药后的第1、3、5和7天评估直接细胞数量。加入Hoechst 33342至终浓度为5 µg/mL，于37 °C孵育30分钟。使用高通量成像细胞仪，选择直接细胞计数以获得总细胞数选项，并设置曝光时间为100,000 ms，读取各孔数据。
  7. 使用配套软件分析读数，导出至电子表格，并采用适当的软件进行统计学分析。
  8. 若在药物处理孔中观察到细胞数量出现统计学显著性减少，则进行"活/死细胞"检测，以确定该减少是否部分由细胞死亡诱导所致。
    1. 按照步骤3.3所述方法，将细胞接种于黑色壁的96孔板中。
    2. 按照步骤3.5所述方法，配制并加入药物。
    3. 在加药后的第1、3、5和7天评估细胞活力与死亡情况。向每孔加入Calcein AM至终浓度1 µM，以及碘化丙啶（propidium iodide）至终浓度1 µM。于37 °C孵育15分钟。
    4. 使用成像细胞仪的活+死细胞 软件选项对细胞进行成像。使用软件分析读数，导出至电子表格，并采用适当的软件进行统计学分析。

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结果

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图5 显示了在每种被筛选的人类细胞系中，核心必需基因（CEGs，标记为 TRUE）与非核心必需基因（非 CEGs，标记为 FALSE）的耗竭评分。每个数据点代表单个基因的耗竭评分倍数变化的 log2 值，叠加在整体评分分布的箱线图上。对每种细胞系中两组之间的耗竭评分均值差异采用 Student t-检验进行分析，结果的 p 值在各图中均有标注。请注意，CEGs 的平均耗竭评分显著高于非 CEGs，这是符合预期的，因为根据定义，核心必需基因在大多数细胞类型中持续参与细胞增殖和/或存活过程。

图6A展示了三种人源MPNST细胞系中筛选出的“命中基因”的维恩图。我们通常发现多个细胞系之间存在大量共有的基因，这些共有的命中基因为高优先级，因为它们编码的蛋白质可能对大部分MPNST细胞的增殖和/或存活至关重要。同时请注意，也存在仅在一个细胞系中被命中的基因。这种情况较为常见，不应将其视为筛选实验质量不佳的证据。对于在多个细胞系中共同命中的...

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讨论

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本文介绍的详细方法旨在研究周围神经系统肿瘤及恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的发病机制。尽管我们发现这些方法行之有效，但仍需认识到本文所述方法存在一些潜在的局限性。下文将讨论这些局限性以及在其他模型系统中可能采用的克服策略。

我们发现，全外显子组测序能有效鉴定 P0-GGFβ3 小鼠中感兴趣的突变。然而，应当认识到全外显子组测序本身存在局限性。首先，全外显子组测序在鉴定融合基因产物方面效果不佳。这是因为大多数染色体断裂及随后的融合主要涉及基因间区域和内含子，而这些区域占基因组的大部分。我们发现，采用双端测序的 RNA-Seq 能更有效地鉴定融合基因。此外，全外显子组测序在识别相对较大的染色体缺失区域方面的有效性也存在疑问。

尽管已有多种算法被开发用于识别此类缺失，但“全外显子组测序”这一术语本身具有误导性，因为在测序效果良好的运行中，外显子组的捕获仍常常会遗漏多达5-10%的外显子区域。因此，我们常规地将全外显子组测序与其他方法（如阵列比较基因组杂交（aCGH））相结合。在识别出拷贝数增加和缺失后，我们检查...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353 和 R01 NS109655 资助 S.L.C.；R01 NS109655-03S1 资助 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 资助 S.L.C.）以及美国国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 资助 S.L.C.）的资助项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物破碎仪超声系统Diagenode UCD-600
CASAVA 1.8.2
CbotIllumina, San Diego, CAN/A
Celigo 图像细胞仪NexcelomN/A
Cellecta 条形码分析与解卷积软件
Citrisolve 混合清洗剂Decon Laboratories5989-27-5
康宁 96 孔黑色微孔板Millipore SigmaCLS3603
Diagenode Bioruptor 15 ml 锥形管Diagenode C30010009
dNTP 混合液Clontech639210
伊红 YThermo Scientific7111
洗脱缓冲液Qiagen 19086
乙醇（200 证明）Decon Laboratories2716
Excel Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’HPLC 纯化
GraphPad PrismDotmatics
哈里斯苏木精Fisherbrand245-677
Illumina HiScanSQIllumina, San Diego, CAN/A
多聚甲醛（4%）Thermo ScientificJ19943-K2
PLUS 转染试剂Thermo Scientific11514015
Polybrene 转染试剂Millipore SigmaTR1003G
PureLink 快速 PCR 纯化试剂盒InvitrogenK310001
Qiagen Buffer P1Qiagen 19051
Qiagen 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq 聚合酶Clontech639210
Trimmomatic 软件www.usadellab.org

参考文献

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