结合人类新生儿肠类器官与失调微生物组的坏死性小肠结肠炎微流控模型

摘要

本方案描述了一种 体外 坏死性小肠结肠炎（NEC）模型，可用于疾病发病机制的机制性研究。该模型采用微流控芯片，芯片中接种了来源于人类新生儿肠道的肠类器官、内皮细胞以及一名重症NEC新生儿的肠道微生物组。

摘要

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种严重且可能致命的肠道疾病，由于其发病机制复杂且尚未完全阐明，对该病的研究一直存在困难。NEC 的病理生理过程包括肠道紧密连接破坏、肠道屏障通透性增加、上皮细胞死亡、微生物群失衡以及炎症反应失调。研究 NEC 的传统工具包括动物模型、细胞系以及人源或小鼠肠道类器官。尽管利用这些模型系统的研究已推动了对疾病病理生理机制的理解，但它们在模拟人类 NEC 复杂性方面仍存在局限性。一种改进的 体外 一种利用微流控技术构建的坏死性小肠结肠炎模型，名为“芯片上的坏死性小肠结肠炎”（NEC-on-a-chip），现已开发成功。该NEC-on-a-chip模型由源自早产新生儿的肠道类器官接种于微流控装置中，并与人血管内皮细胞及来自重症NEC患儿的微生物组共培养而成。此模型为研究NEC发病机制提供了有力工具，也为新生儿肠道疾病的药物发现与测试提供了新资源。本文将对该NEC-on-a-chip模型进行详细描述。

引言

坏死性小肠结肠炎（NEC）影响早产儿，在出生体重< 1500 g的婴儿中发病率高达10%¹。NEC的病理生理机制复杂，包括肠上皮损伤、肠道紧密连接破坏、肠道屏障通透性增加、免疫失调以及上皮细胞死亡^2,3。目前对NEC发病机制中涉及的分子机制仍不完全清楚，尽管已有数十年的研究，但至今仍缺乏有效的靶向治疗手段。

推进坏死性小肠结肠炎（NEC）研究的一个重要障碍是，从人类婴儿中分离获得的原代肠组织数量有限且体积较小。来自NEC患儿的切除肠组织通常已发生坏死并严重受损，这使得对疾病发生前机制的研究变得复杂。例如，NEC患儿的小肠中充满大量免疫细胞，同时观察到肠干细胞数量减少、上皮细胞增殖降低以及上皮细胞凋亡增加^4,5,6,7。这导致从这些样本中培养肠上皮细胞，以及分离RNA和蛋白质存在困难，而这些分子在强烈的炎症环境中可能已被降解。此外，由于手术干预时患儿的疾病进程通常已处于晚期，因此无法开展针对诱发疾病因素的机制性研究。这些局限性使得目前对NEC机制的研究主....

方案

类器官源自早产儿（妊娠22至36周出生）的小肠组织样本，这些样本是在因坏死性小肠结肠炎（NEC）或其他非炎症性病因导致的肠道疾病接受手术时获取的。所有样本的采集和处理均在获得知情同意，并经圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（IRB方案编号：201706182和201804040）以及北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会（IRB方案编号：21-3134）批准后进行。

1. 从人类新生儿小肠中分离隐窝并进行铺板以建立肠类器官

1. 培养基制备
   1. 按照表1所述准备所有所需培养基。所有培养基制备过程中均需采用无菌操作技术。使用0.2 µm滤器过滤除菌，并于4 °C保存至使用。
2. 清洗与切碎肠道组织
   1. 将细胞培养基质水凝胶置于冰上融化。从手术室获取人肠道组织，立即将样本放入5 mL冰上预冷的组织洗涤培养基中，以灭活内源性蛋白酶。
   2. 使用装有修剪过P1000移液器吸头的10 mL注射器，以冰上预冷的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗肠腔内容物。将肠道组织转移至含有5 mL冰上预冷D-PBS的35 mm培养皿中。
   3. 沿纵向切开肠道组织以暴露肠腔，并用精细剪刀将其剪成小块。通过在组织培养皿中轻轻振荡D-PBS对肠道组织进行冲洗。
   4. 将组织碎片转移至一个新的洁净....

结果

将肠类器官接种到微流控装置上（图1），并按照上述方法进行培养。通过明场显微镜观察接种前肠类器官在细胞培养基质水凝胶中的生长情况，以及接种装置后肠上皮细胞单层的后续扩展情况（图2）。肠上皮细胞形成融合的单层结构，并进一步发育为成熟的三维绒毛样结构（图2）。这种接种了由肠类器官衍生的新生肠道上皮细胞和HIMECs的微流控装置，被称为新生肠道芯片模型³⁶。

NEC-on-a-chip 模型的建立旨在模拟新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）期间存在的微生物群失衡状态。该模型将来自患有重度 NEC 的新生儿的失衡微生物群添加至新生儿肠芯片模型中。在引入该失衡微生物群后，检测到一系列促炎性细胞因子的表达显著升高，包括肿瘤坏死因子α（TNFα； 图3）、白细胞介素（IL）-1β（I.......

讨论

该“芯片上的坏死性小肠结肠炎”（NEC-on-a-chip）系统是一种强大的新型工具，可用于模拟坏死性小肠结肠炎的病理生理过程。该平台提供了一个更为复杂的微环境，能够更接近地模拟人体肠道的生理条件 体内 通过引入具有持续管腔流和拉伸作用的共培养系统，该模型比以往模型更接近肠道微环境。这些条件促进了三维绒毛样结构的发育，其表面由高度极化的上皮细胞衬覆，包含成熟的上皮亚型细胞和紧密连接（图2)³⁶此外，该模型的上皮顶端表面易于接触实验刺激物，例如患者来源的微生物群或新型治疗药物。最后，通过利用来自相关患者群体的肠类器官，该模型还可用于研究多种炎症性和非炎症性肠道疾病，以及正常肠上皮发育的机制。该模型能够从单个患者样本中最大化获取数据，鉴于新生儿肠道样本的数量有限且体积较小，这一点尤为重要。

利用该模型，观察到了早产儿发生坏死性小肠结肠炎（NEC）期间肠道上皮发生的多种生理变化。添加来自重症NEC患者的失调菌群后，导致促炎性细胞因子上调（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[Leu15]-胃泌素 I 人	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
高级DMEM/F12培养基	Gibco	12634010
B-27添加剂，无血清（50倍浓缩）	Gibco	17504044
基础生物实验套装	模拟	N/A
BioTek Synergy 2 多功能微孔板读板仪	安捷伦	7131000
BRAND 甲基丙烯酸甲酯（PMMA）比色皿，半微量	BrandTech	759085D
细胞回收溶液	康宁	354270
CFX Opus 实时荧光定量 PCR 系统	伯乐（Bio-Rad）	12011319
芯片支架	模拟	N/A
Chip-S1 可拉伸芯片	模拟	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
透明TC处理的多孔板，  48 孔板	康宁	3548
人胎盘胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C5533
I型胶原酶，粉末状	Gibco	17018029
含试剂盒的完全人内皮细胞培养基	细胞生物学	H-1168
15 mL 锥形聚丙烯离心管	Fisher Scientific	05-539-12
50 mL 圆锥形聚丙烯离心管	Fisher Scientific	05-539-8
Countess 细胞计数板载玻片	Invitrogen	C10283
Countess II 自动细胞计数仪	Invitrogen	AMQAX1000
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
葡聚糖，级联蓝，3000 分子量，阴离子型，赖氨酸可固定	Invitrogen	D7132	通透性染料
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
一次性PES滤器，0.2 μm aPES膜	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
驴血清	Sigma-Aldrich	D9663
杜尔贝科′s 改良伊格尔′s 中等-高葡萄糖培养基	Sigma-Aldrich	D5796
杜尔贝科′磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	14190-136
EDTA，0.5 M，  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 表面活化试剂	模拟	ER-1	芯片活化试剂1
ER-2 表面活化试剂	模拟	ER-2	芯片活化试剂2
人血浆纤维连接蛋白	Gibco	33016015
Fisherbrand 带透明盖的培养皿，100 mm	Fisher Scientific	FB0875713
明胶基包被溶液	细胞生物学	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
庆大霉素	Gibco	15750060
HEPES，液体，1 M 溶液（238.3 mg/mL）	康宁	25-060-CI
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物	Invitrogen	H3570
人Ⅰ型胶原蛋白	Sigma-Aldrich	CC050
人原代小肠微血管内皮细胞	细胞生物学	H-6054
倒置显微镜	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp 通用型高级水浴锅	Fisher Scientific	FSGPD10
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081
Luria肉汤（LB）琼脂，Miller	Supelco	L3027
L-WRN 细胞	美国典型培养物保藏中心	CRL-3276
生长因子减少型基底膜基质（Matrigel），无LDEV	康宁	356231	细胞培养基质
N-2 补充剂（100 倍浓缩）	Gibco	17502048
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR 紫外灯	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC 微体积紫外-可见分光光度计	赛默飞世尔科技	840-274200
烟酰胺	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 中心模块	模拟	N/A
多聚甲醛	赛默飞世尔科技	047392.9L
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010023
Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod 便携式模块	模拟	N/A
优质级胎牛血清（FBS）（热灭活）	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect 反转录试剂盒	QIAGEN	205313
重组小鼠表皮生长因子（EGF）	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
带手柄方形生物检测培养皿，未经TC处理	康宁	431111
SsoAdvanced Universal SYBR 绿色超级混合液	伯乐（Bio-Rad）	1725271
Steriflip-GV 无菌离心管顶部滤器单元	默克密理博	SE1M179M6
无菌细胞筛，70 μm	Fisher Scientific	22-363-548
无菌注射器，10 mL	Fisher Scientific	14-955-453
直头、精细、尖锐剪刀	Miltex 仪器	MH5-300
赛默飞世尔科技 Sorvall X4R Pro-MD 离心机	赛默飞世尔科技	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	去垢剂
TRIzol试剂	Invitrogen	15596026	RNA提取试剂
台盼蓝溶液，0.4%（w/v）在 PBS 中，pH 7.5 ± 0.5	康宁	25-900-CI
TrypLE Express 酶（1X），无酚红	Gibco	12604013	酶解解离试剂
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 培养箱，165 L	赛默飞世尔科技	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
动物学ë-CM1 培养模块	模拟	N/A