Summary

Purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus

Published: June 02, 2023
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Summary

Ici, nous présentons une méthode de purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus qui est simple, peu coûteuse et efficace.

Abstract

L’enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE) est un nouvel agent fibrinolytique qui peut à la fois activer le plasminogène en plasmine et dégrader directement la fibrine, montrant de grands avantages par rapport aux agents thrombolytiques traditionnels. Cependant, en raison du manque d’informations structurelles, tous les programmes de purification de la sFE sont basés sur des purifications chromatographiques en plusieurs étapes, trop compliquées et coûteuses. Ici, un protocole de purification d’affinité de sFE est développé pour la première fois basé sur une structure cristalline de sFE; il comprend la préparation de l’échantillon brut et de la colonne de chromatographie d’affinité matricielle lysine/arginine-agarose, la purification par affinité et la caractérisation de la sFE purifiée. En suivant ce protocole, un lot de sFE peut être purifié en 1 jour. De plus, la pureté et l’activité de la sFE purifiée augmentent à 92% et 19 200 U/mL, respectivement. Il s’agit donc d’une approche simple, peu coûteuse et efficace pour la purification de la sFE. Le développement de ce protocole est d’une grande importance pour l’utilisation ultérieure de la sFE et d’autres agents similaires.

Introduction

La thrombose est une menace majeure pour la santé publique, en particulier suite à la pandémie mondiale de Covid-19 1,2. Cliniquement, de nombreux activateurs du plasminogène (AP), tels que l’activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) et l’urokinase (Royaume-Uni), ont été largement utilisés comme médicaments thrombolytiques. Les AP peuvent activer le plasminogène des patients en plasmine active pour dégrader la fibrine. Ainsi, leur efficacité thrombolytique est fortement limitée par le statut plasminogènedes patients 3,4. Les agents fibrinolytiques, tels que la plasmine métalloprotéinase et la sérine plasmine, sont un autre type de médicament thrombolytique clinique qui comprend également des enzymes fibrinolytiques (FE) telles que la plasmine, qui peuvent dissoudre directement les caillots mais sont rapidement inactivées par divers inhibiteurs de la plasmine5. Par la suite, un nouveau type d’agent fibrinolytique a été signalé qui peut dissoudre le thrombus non seulement en activant le plasminogène en plasmine, mais aussi en dégradant directement la fibrine 6-l’enzyme fibrinolytique de l’ancien ver d’arachide Sipunculus nudus (sFE)6. Cette bifonction confère à la sFE d’autres avantages par rapport aux médicaments thrombolytiques traditionnels, en particulier en termes de statut plasminogène anormal. Par rapport à d’autres agents fibrinolytiques bifonctionnels 7,8,9, la sFE présente plusieurs avantages, y compris la sécurité, par rapport aux agents dérivés non alimentaires pour le développement de médicaments, en particulier pour les médicaments oraux. En effet, la biosécurité et la biocompatibilité de Sipunculus nudus ont été bien établies10.

Semblable aux autres agents fibrinolytiques naturels isolés à partir de micro-organismes, de vers de terre et de champignons, la purification de la sFE de S. nudus est très compliquée et comprend plusieurs étapes, telles que l’homogénéisation des tissus, la précipitation du sulfate d’ammonium, le dessalement, la chromatographie par échange d’anions, la chromatographie d’interaction hydrophobe et le tamisage moléculaire10,11,12. Un tel système de purification dépend non seulement de compétences compétentes et de matériaux coûteux, mais nécessite également plusieurs jours pour terminer l’ensemble de la procédure. Par conséquent, un programme de purification simple de la sFE est d’une grande importance pour le développement ultérieur de la sFE. Heureusement, deux cristaux de sFE (PDB: 8HZP; PDB : 8HZO) ont été obtenus avec succès (voir Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplémentaire 2). Grâce à des analyses structurelles et à des expériences d’amarrage moléculaire, nous avons constaté que le noyau catalytique de la sFE pouvait spécifiquement se lier à des cibles contenant des résidus d’arginine ou de lysine.

Ici, un système de purification par affinité a été proposé pour la première fois, basé sur la structure cristalline de la sFE. En suivant ce protocole, la sFE hautement pure et hautement active pourrait être purifiée à partir des extraits bruts en une seule étape de purification par affinité. Le protocole développé ici est non seulement important pour la préparation à grande échelle de sFE, mais peut également être appliqué pour la purification d’autres agents fibrinolytiques.

Protocol

1. Préparation Traitement des échantillonsDisséquer soigneusement S. nudus frais (100 g) et recueillir l’intestin et son liquide interne. Ajouter 300 mL de tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) pour l’homogénéisation (1 000 tr/min, 60 s). Congeler-décongeler l’homogénat 3x. Centrifuger l’échantillon (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) et prélever le surnageant. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.</li…

Representative Results

À la suite de ce protocole, des lysats tissulaires bruts ont été extraits, des colonnes de chromatographie de chromatographie matricielle arginine-agarose et lysine-agarose ont été construites, du sFE purifié a été obtenu et la pureté et l’activité fibrinolytique de la sFE purifiée ont été mesurées par SDS-PAGE et des plaques de fibrine, respectivement. Après centrifugation, le surnageant recueilli était un liquide visqueux transparent bronzé. Les précipitations ont commenc…

Discussion

En raison de l’indisponibilité de la séquence génétique exacte de la sFE, la sFE actuellement utilisée a été extraite de S. nudus14 frais. De plus, les procédures de purification de la sFE rapportées dans la littérature étaient compliquées et coûteuses, car elles étaient basées sur certaines caractéristiques générales de la sFE, telles que le poids moléculaire, le point isoélectrique, la force ionique et la polarité15,16<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par le Bureau de la science et de la technologie de la ville de Xiamen (3502Z20227197) et le Bureau de la science et de la technologie de la province du Fujian (n ° 2019J01070, n ° 2021Y0027).

Materials

30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) Biosharp
2-Mercaptoethanol Solarbio
Agarose G-10 Biowest
Ammonium persulfate SINOPHARM
Ammonium sulfate SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B Solarbio Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB) Solarbio
Fast Silver Stain Kit Beyotime
Fibrinogen Merck
Glycine Solarbio
Hydrochloric acid SINOPHARM
Kinase RHAWN
Lysine-Sepharose 4B Solarbio Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) Beyotime
Sodium chloride SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide SINOPHARM
Thrombin Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 SANYO
Chemiluminescence Imaging System GE
Constant Flow Pump BT-100 QITE
Constant Temperature Incubator JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II SCIENTZ
Electronic Analytical Balance DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker Kylin-Bell
Ice Machine AF 103 Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner ShuMei
Magnetic Stirrer Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W Cence
Microwave Oven Galanz
Milli-Q Reference Millipore
Pipettor Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System Bio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL) Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL) NEST
Centrifuge Tube (7 mL) Biosharp
Culture Dish (60 mm) NEST
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP
Parafilm Bemis
Pipette Tip (1 mL ) KIRGEN
Pipette Tip (10 µL) Axygene
Pipette Tip (200 µL) Axygene
Special Indicator Paper TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) Millipore
Universal pH Indicator SSS Reagent

References

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Cite This Article
Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus. J. Vis. Exp. (196), e65631, doi:10.3791/65631 (2023).

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