Summary

Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

Published: September 08, 2023
doi:

Summary

In dieser Arbeit wird beschrieben, wie polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet werden kann, um die lokale Organisation in markierungsfreien Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu charakterisieren. Außerdem wird beschrieben, wie die Probe vorbereitet und gemessen, der erforderliche Aufbau zusammengestellt und die Daten analysiert werden, um Informationen über die lokale Organisation von Amyloidfibrillen zu erhalten.

Abstract

Im Vergleich zu ihrem Ein-Photonen-Gegenstück ist die Zwei-Photonen-Anregung für Bioimaging-Experimente von Vorteil, da sie eine geringere Phototoxizität, ein tieferes Eindringen in das Gewebe, einen effizienten Betrieb in dicht gepackten Systemen und eine reduzierte Winkelphotoselektion von Fluorophoren bietet. Die Einführung der Polarisationsanalyse in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie (2PFM) ermöglicht somit eine präzisere Bestimmung der molekularen Organisation in einer Probe im Vergleich zu Standard-Bildgebungsverfahren, die auf linearen optischen Verfahren basieren. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf polarisationsempfindliches 2PFM (ps-2PFM) und seine Anwendung bei der Bestimmung der molekularen Ordnung in komplexen Biostrukturen-Amyloid-Sphäroliten. Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson werden häufig durch den Nachweis von Amyloid-Protein-Aggregaten diagnostiziert, die aufgrund eines gestörten Proteinfehlfaltungsprozesses gebildet werden. Die Erforschung ihrer Struktur führt zu einem besseren Verständnis ihres Entstehungsweges und folglich zur Entwicklung empfindlicherer diagnostischer Methoden. In dieser Arbeit wird das ps-2PFM vorgestellt, das für die Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten und sphärischen amyloidogenen Proteinaggregaten geeignet ist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die vorgeschlagene Technik die dreidimensionale Organisation von Fibrillen im Inneren des Sphäruliths auflösen kann.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten wurden zwar zahlreiche fluoreszenzmikroskopische Techniken für die Biobildgebung von Proteinen und ihren Aggregatenentwickelt 1, aber nur wenige wurden verwendet, um ihre lokale Ordnung innerhalb der Probe aufzulösen 2,3. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie4 wurde verwendet, um die intrinsische strukturelle Heterogenität von Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu untersuchen. Darüber hinaus konnte die quantitative Bestimmung der lokalen Ordnung in komplexen und dicht gepackten Biostrukturen wie Sphäroliten mit polarisationssensitiven Methodenaufgelöst werden 3. Standard-Fluoreszenztechniken mit oberflächlicher Gewebepenetration sind jedoch begrenzt, da die Verwendung von UV-VIS-Wellenlängen zur Anregung von Fluorophoren in vivo zu einer hohen Gewebelichtstreuung führt5. Darüber hinaus erfordert eine solche Bildgebung häufig die Entwicklung und Bindung spezifischer Fluoreszenzsonden an ein Zielbiomolekül, wodurch die Kosten und der Arbeitsaufwand für die Durchführung der Bildgebung erhöht werden.

Um diese Probleme anzugehen, hat unser Team kürzlich die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (ps-2PFM) für die markierungsfreie Abbildung biologischer Strukturen angepasst 6,7. Ps-2PFM ermöglicht die Messung der Abhängigkeit der Zwei-Photonen-Fluoreszenzintensität von der Richtung der linearen Polarisation des Anregungsstrahls und die Analyse der Polarisation der emittierten Fluoreszenz8. Die Implementierung dieser Technik erfordert die Ergänzung des Standard-Multiphotonenmikroskop-Anregungspfads (Abbildung 1) um eine Halbwellenplatte zur Steuerung der Lichtpolarisationsebene. Dann werden Polargraphen, die die Abhängigkeit der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzintensität von der Polarisation des Anregungslaserstrahls darstellen, aus Signalen erstellt, die von zwei Avalanche-Photodioden gesammelt werden, und so die beiden zueinander senkrechten Komponenten der Fluoreszenzpolarisation sammeln.

Der letzte Schritt ist der Datenanalyseprozess, bei dem der Einfluss der optischen Elemente, wie z. B. dichroitische Spiegel oder ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur, auf die Polarisation berücksichtigt wird. Aufgrund der Beschaffenheit des Zwei-Photonen-Prozesses bietet diese Methode sowohl eine reduzierte Winkel-Photoselektion als auch eine verbesserte axiale Auflösung, da die Zwei-Photonen-Anregung von Fluorophoren außerhalb der Fokusebene probabilistisch begrenzt ist. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass ähnliche Methoden erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung von Nahinfrarot-Sonden (NIR) für die Tiefengewebebildgebung eingesetzt werden können9. Ps-2PFM wurde zuvor zur Abbildung von Fluorophoren in Zellmembranen10 und DNA11,12 sowie von Nicht-Standard-Fluoreszenzmarkern biologischer Systeme, wie z. B. Goldnanopartikeln13, eingesetzt. In all diesen Beispielen wurde die Information über die Organisation von Biomolekülen jedoch indirekt gewonnen und erforderte eine vordefinierte gegenseitige Orientierung zwischen einem Fluorophor und einem Biomolekül.

In einer unserer jüngsten Arbeiten haben wir gezeigt, dass ps-2PFM erfolgreich zur Bestimmung der lokalen Polarisation der Autofluoreszenz von Amyloid-Überstrukturen und der Fluoreszenz von Thioflavin T, einem Amyloid-spezifischen Farbstoff, der an Amyloidfibrillen in Sphäroliten gebunden ist, eingesetzt werden kann6. Darüber hinaus haben wir in einer anderen Studie bewiesen, dass ps-2PFM verwendet werden kann, um die Orientierung von Amyloidfibrillen in Amyloid-Sphäroliten in einem Submikrometer-Größenbereich zu detektieren, was durch Korrelation mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt wurde7. Das Erreichen dieses Ergebnisses war möglich dank i) der intrinsischen Autofluoreszenz von Sphärolith-Amyloiden, die mit einem oder zwei Photonen angeregt werden, eine intrinsische Autofluoreszenz mit Emissionsmaxima in einem Bereich von 450 bis 500 nm und Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitten aufweisen, die mit Standard-Fluoreszenzfarbstoffen vergleichbar sind14, ii) mathematische Modelle, die zuvor eingeführt wurden, um zu beschreiben, wie ps-2PEF von Farbstoffen, die biologische Membranen und DNA-Strukturen markieren, angewendet werden könnte Fluoreszenz von Sphäroliten und an sie gebundenen Farbstoffen 8,11,15. Bevor wir mit der Analyse fortfahren, empfehlen wir daher dringend, die erforderliche Theorie durchzusehen, die sowohl im Haupttext als auch in den unterstützenden Informationen unseres ersten Artikels zu diesem Themabeschrieben ist 6. In dieser Arbeit stellen wir das Protokoll zur Anwendung der ps-2PFM-Technik für eine markierungsfreie Amyloid-Strukturcharakterisierung von bovinen Insulinsphäroliten vor.

Protocol

1. Präparation der Objektträger mit ausgewachsenen Sphäroliten HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Alle Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser (18,2 MΩ·cm bei 25 °C) hergestellt, das aus dem Wasseraufbereitungssystem gewonnen wurde. Inkubieren Sie die Amyloid-Sphärulite auf der Grundlage des von Krebs et al.16….

Representative Results

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung durch die Vorbereitung von Amyloid-Suprastrukturen für Tests mit ps-2PFM, den Aufbau des mikroskopischen Systems und die Messungen der richtigen Probe. Vor den endgültigen Messungen ist es jedoch wichtig, die APDs richtig auf eine isotrope Referenz auszurichten, was dazu führen sollte, dass auf beiden Detektoren ein symmetrisches Signal ähnlicher Form und Intensität gesammelt wird (Abbildung 4C). Selbst minimale Unter…

Discussion

Die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der lokalen Anordnung von Fibrillen innerhalb der Amyloid-Überstrukturen, das nur kleine Modifikationen des Standard-Multiphotonen-Aufbaus erfordert. Da sie mit nichtlinearen optischen Phänomenen arbeitet, können im Vergleich zu Methoden der einphotonenangeregten Fluoreszenzmikroskopie eine reduzierte Winkelphotoselektion und eine verbesserte axiale Auflösung erreicht werden. Darüber hinaus führt es zu einer geringe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Projekt Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) unterstützt, das vom Nationalen Wissenschaftszentrum in Polen finanziert wird.

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures – local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc’h, V., Brasselet, S., Roch, J. -. F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer’s disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., Mély, Y., Duportail, G., et al. . Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. , 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Play Video

Cite This Article
Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

View Video