本方案描述了推拿干预碘乙酸钠注射诱导的大鼠膝骨关节炎（KOA）模型的方法，为推拿在KOA动物模型中的应用提供了参考。本方案还研究了推拿治疗KOA的有效机制，研究结果将有助于推动其临床应用。
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摘要
摘要
膝骨关节炎（KOA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是慢性疼痛和功能障碍，可进展为关节不可逆的结构损伤。研究膝关节炎中关节软骨、肌肉、滑膜及膝关节周围其他组织之间的关联具有重要意义。目前，KOA 的管理包括生活方式调整、运动、药物治疗和手术干预；然而，对于 KOA 相关疼痛复杂机制的阐明仍显不足。因此，KOA 疼痛仍是临床治疗中的关键挑战和重点干预目标。推拿已被发现对运动系统、免疫系统和内分泌系统具有调节作用，这促使人们探索推拿是否能够缓解由炎症因子上调所引起的 KOA 症状，以及骨骼肌中的炎症因子是否可能加剧 KOA 的进展。
将32只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（180-220 g）随机分为四组，每组8只：抗PD-L1联合推拿组（A组）、模型组（B组）、推拿组（C组）和假手术组（D组）。对A、B、C组大鼠，向右膝关节腔内注射25 µL单碘乙酸钠（MIA）溶液（4 mg MIA溶于25 µL无菌生理盐水中）；D组则注射等量的无菌生理盐水。所有组别在注射前以及注射后第2、9、16天，依次采用从最不具应激性到最具应激性的测试方法进行评估，包括足底机械缩足阈值、热缩足潜伏期、右膝关节肿胀度、Lequesne MG评分和皮肤温度。
引言
膝骨关节炎（KOA）是一种常见的退行性骨关节炎，其特征是慢性疼痛和功能障碍，较严重的KOA将导致关节不可逆的结构损伤1。全球范围内KOA的高患病率已成为重大的公共卫生挑战2,3，严重影响患者的生活质量4,5。研究表明，全球有超过2.6亿人受KOA影响6。随着人口老龄化，中国40岁以上人群KOA的总患病率高达17.0%，给患者家庭带来沉重负担7,8。
根据中医理论，膝骨关节炎（KOA）属于"痹证"9范畴，《黄帝内经》将筋、骨、肉与痹证相联系。因此，在KOA中，我们需要关注软骨、肌肉、滑膜以及膝关节周围其他组织之间的关联。在现代医学中，肌肉和骨骼的炎症作为关节炎免疫稳态的主要组成部分，推动了KOA疼痛的进展。然而，大多数研究集中于骨关节的软骨炎症和滑膜炎症，关于骨骼肌中炎症现象的研究报道较少。因此，需要开展更多关于骨骼肌在炎症中作用的研究，以更全面地理解KOA，并为更有效的治....
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方案
所有实验均经上海中医药大学动物护理与使用委员会批准并监督（批准编号：SYXK2018-0040），符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》的规定。
1. 动物准备
- 将32只8周龄、体重180-220 g的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠饲养于特定病原体阴性环境中，温度为24 ± 2 °C，湿度60%，光照周期为12 h明/12 h暗，并给予标准啮齿类颗粒饲料。所有动物实验操作均符合实验动物福利伦理及动物实验安全规范。
- 经过1周适应性喂养后，将大鼠随机分为四组，每组8只，分别为：抗PD-L1联合推拿组（A组）、模型组（B组）、推拿组（C组）和假手术组（D组）。
2. 膝关节内注射单碘乙酸钠（MIA）
注意：除D组外，所有组均通过向膝关节腔内注射MIA制备KOA大鼠模型。对于D组，向右侧膝关节腔内注射25 µL无菌生理盐水。
- 将大鼠置于麻醉箱中，通入2.5%异氟烷直至其完全麻醉。通过观察幼年大鼠仰卧、四肢停止活动，并对脚趾夹捏（屈肌反射）、眼睑反射及肌肉松弛无反应，确认其已完全麻醉。
- 为防止麻醉期间眼部干燥，需在麻醉后的幼年大鼠眼部涂抹宠物眼膏并滴加眼药水。
- 剃除大鼠右侧后肢的毛....
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结果
该方案在中国上海岳阳中西医结合医院的临床环境中实施。图1展示了在大鼠身上按压的各个穴位的确切位置，表1列出了刺激这些穴位的常见益处。表2和表3提供了有力证据，表明即使在未抑制PD-1通路的情况下，推拿治疗仍可实现显著的镇痛效果。表4、表5以及图2中的研究结果进一步说明了推拿治疗与膝骨关节炎（KOA）进展之间的相关性，提示手法治疗可能作为辅助手段，用于改善大鼠KOA症状的管理。我们对手法治疗联合抗PD-L1（MTA）组的每只大鼠在MIA诱导骨关节炎3天后，注射200 µg剂量的抗PD-L1抗体以阻断该通路。随后，在骨关节炎造模后第3天起，每隔2天对大鼠的穴位（包括EX-LE4、ST35、SP10、ST34、SP9和GB34）进行一次手法治疗，采用指揉法，持续2周。
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讨论
本研究旨在通过标准化的行为学指标评估推拿干预对膝骨关节炎（KOA）的改善效果，并探讨推拿治疗KOA的作用机制以及骨骼肌与KOA之间的关联。与药物和手术治疗不同，推拿对运动系统、免疫系统和内分泌系统具有积极的调节作用。推拿可通过作用于不同靶点缓解疾病引起的炎症和疼痛。例如，通过调控TLR4通路和miRNA，推拿可抑制胶质细胞的活化，调节异常的脑功能，调控下游炎症性细胞因子，并抑制外周炎症反应25,26,27同时，推拿还可干预慢性疼痛疾病中功能失调的自主神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴，从而有助于恢复自主神经系统的稳态，并触发免疫内分泌反应，通过调节内分泌和生理过程缓解疼痛。28,29,30此外，当推拿对外部肌肉进行刺激时，可引起副交感神经兴奋
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（编号：82105042，82205302）；上海市“超级博士后”激励计划（编号：2020371）；中国博士后科学基金（编号：2021M692156）；上海市扬帆计划（编号：20YF1450900）；上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院科研基金（编号：2021yygq03）资助。资助方在研究的设计、实施及撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗PD-L1抗体 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab80276 | |
| 电动von Frey感觉计 | IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA | ALMEMO 2450 | |
| GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | 用于统计分析的软件 | |
| 单碘乙酸钠 | Sigma-Aldrich Inc | I9148 | 溶于生理盐水用于注射 |
| 戊基巴比妥钠 | Sigma-Aldrich Inc | P3761 | |
| 雄性Sprague Dawley (SD) 大鼠 | 上海吉辉实验动物养殖有限公司 | 编号 SCXK (沪) 2017-0012 | |
| 热痛觉测试仪 | IITC/Life Science | 型号 390 |
参考文献
- Katz, J. N., et al. Diagnosis and treatment of hip and knee osteoarthritis: A review. JAMA. 325 (6), 568-578 (2021).
- Culvenor, A. G., et al. Prevalence of knee osteoarthritis features on magne....
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