Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse

Summary

Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV’s) uit biovloeistoffen hebben de laatste tijd veel aandacht gekregen op het gebied van vloeibare biopsie. Ze worden vrijgegeven door bijna elk type cel, bieden een real-time momentopname van gastheercellen en bevatten een schat aan moleculaire informatie, waaronder eiwitten, met name die met posttranslationele modificaties (PTM’s) zoals fosforylering, als de belangrijkste speler van cellulaire functies en het begin en de progressie van de ziekte. De isolatie van EV’s uit biovloeistoffen blijft echter een uitdaging vanwege de lage opbrengsten en onzuiverheden van de huidige EV-isolatiemethoden, waardoor de stroomafwaartse analyse van EV-lading, zoals EV-fosfoproteïnen, moeilijk wordt. Hier beschrijven we een snelle en effectieve EV-isolatiemethode op basis van gefunctionaliseerde magnetische kralen voor EV-isolatie uit biovloeistoffen zoals menselijke urine en stroomafwaartse proteomics- en fosfoproteomics-analyse na EV-isolatie. Het protocol maakte een hoog terugwinningsrendement van urinaire EV’s en gevoelige profielen van EV-proteoom en fosfoproteoom mogelijk. Verder komen hier ook de veelzijdigheid van dit protocol en relevante technische overwegingen aan bod.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn membraaningekapselde nanodeeltjes die door alle soorten cellen worden uitgescheiden en aanwezig zijn in biovloeistoffen zoals bloed, urine, speeksel, enz.1,2,3,4. EV’s vervoeren een lading van diverse bioactieve moleculen die de fysiologische en pathologische toestand van hun gastheercellen weerspiegelen en daarom fungeren als cruciale factoren in ziekteprogressie ^4,5,6. Bovendien hebben uitgebreide studies aangetoond dat op EV gebaseerde ziektemarkers kunnen worden geïdentificeerd voorafgaand aan het begin van de symptomen of de fysiologische detectie van tumoren ^5,6,7.

Fosforylering fungeert als een belangrijk mechanisme in cellulaire signalering en regulatie. Daarom bieden fosfoproteïnen een waardevolle bron voor de ontdekking van biomarkers, aangezien afwijkende fosforyleringsgebeurtenissen geassocieerd zijn met ontregelde cellulaire signaalroutes en de ontwikkeling van metastatische ziekten zoals kanker ^8,9,10. Hoewel het profileren van de fosforyleringsdynamiek de identificatie van ziektespecifieke fosfoproteïnesignaturen als potentiële biomarkers mogelijk maakt, vormen de lage abundantie en dynamische aard van fosfoproteïnen grote uitdagingen bij de ontwikkeling van fosfoproteïnen als biomarkers^11,12. Met name de laag-overvloedige fosfoproteïnen die zijn ingekapseld in EV’s worden beschermd tegen externe enzymatische vertering in de extracellulaire omgeving⁸. Bijgevolg bieden EV’s en van EV afgeleide fosfoproteïnen een ideale bron voor de ontdekking van biomarkers bij de vroege detectie van kanker en andere ziekten.

Hoewel analyse van eiwitfosforylering in EV’s een waardevolle bron biedt voor het begrijpen van kankersignalering en ziektediagnose in een vroeg stadium, vormt het gebrek aan efficiënte EV-isolatiemethoden een grote barrière. EV-isolatie wordt gewoonlijk bereikt door differentiële ultracentrifugatie (DUC)¹³. Deze methode is echter tijdrovend en niet geschikt voor klinische implicaties vanwege de lage doorvoer en slechte reproduceerbaarheid^13,14. Alternatieve EV-isolatiebenaderingen, zoals polymeer-geïnduceerde precipitatie¹⁵, worden beperkt door een lage specificiteit als gevolg van co-precipitatie van niet-EV-eiwitten. Op affiniteit gebaseerde benaderingen, waaronder op antilichamen gebaseerde affiniteitsvangst¹⁶ en affiniteitsfiltratie¹⁷, bieden een verbeterde specificiteit, maar zijn beperkt tot een relatief laag herstelpercentage vanwege het kleine volume.

Om de problemen bij het onderzoeken van de dynamiek van fosfoproteïnen in EV’s aan te pakken, heeft onze groep een extracellulaire blaasjes total recovery and purification (EVtrap)-techniek ontwikkeld op basis van chemische affiniteit om EV’s op te vangen op gefunctionaliseerde magnetische kralen¹⁸. Eerdere resultaten hebben aangetoond dat deze EV-isolatiemethode op basis van magnetische parels zeer effectief is in het isoleren van EV’s uit een breed scala aan biovloeistofmonsters en in staat is om een veel hogere EV-opbrengst te bereiken terwijl verontreiniging wordt geminimaliseerd in vergelijking met DUC en andere bestaande isolatiemethoden^18,19. We hebben met succes gebruik gemaakt van EVtrap en een op titanium gebaseerde fosfopeptideverrijkingsmethode die is ontwikkeld door onze groep²⁰ om het fosfoproteoom van EV’s afgeleid van diverse biovloeistoffen te profileren en om potentiële fosfoproteïne-biomarkers voor verschillende ziekten te detecteren 19,21,22.

Hier presenteren we een protocol op basis van EVtrap voor het isoleren van circulerende EV’s. Het protocol richt zich op de urinaire EV’s. We demonstreren ook de karakterisering van geïsoleerde EV’s met behulp van western blotting. Vervolgens beschrijven we de monstervoorbereiding en de verwerving van massaspectrometrie (MS) voor zowel proteomics- als fosfoproteomics-analyses. Dit protocol biedt een efficiënte en reproduceerbare workflow voor het profileren van het urinaire EV-proteoom en fosfoproteoom, wat verdere studies naar EV’s en hun klinische toepassingen zal vergemakkelijken²³.

Protocol

Alle urinemonsters werden verzameld bij gezonde personen na geïnformeerde toestemming. De experimenten voldeden aan alle ethische normen met betrekking tot menselijke monsters en aan de richtlijnen van het Purdue University Human Research Protection Program. 1. Monstername Centrifugeer 12 ml urinemonster in een conische centrifugebuis van 15 ml gedurende 10 minuten bij 2.500 x g, 4 °C om celresten en grote apoptotische lichamen te verwijderen. Br…

Representative Results

Dit protocol demonstreert een uitgebreide workflow van de isolatie van EV’s tot stroomafwaartse proteomics- en fosfoproteomics-analyses (Figuur 1). De drievoudige urinemonsters werden onderworpen aan EV-isolatie. De geïsoleerde EV’s werden gekenmerkt door western blotting en vervolgens verwerkt voor op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-monstervoorbereiding, waaronder eiwitextractie, enzymatische vertering en het opruimen van peptiden. Voor de analyse van fosfoproteomics werden de fos…

Discussion

Effectieve EV-isolatie is een essentiële voorwaarde voor het detecteren van laagfrequente eiwitten en fosfoproteïnen in EV’s. Ondanks de ontwikkeling van talrijke methoden om aan deze behoefte te voldoen, heeft de meerderheid nog steeds last van beperkingen zoals slecht herstel of lage reproduceerbaarheid, die het gebruik ervan in grootschalige onderzoeken en routinematige klinische omgevingen belemmeren. DUC wordt over het algemeen beschouwd als de meest gebruikelijke methode voor EV-isolatie, en de extra wasstappen w…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007