肌腱中基因表达水平的空间高分辨率分析

摘要

本文介绍了一种优化的肌腱原位杂交实验方案。in situ 方法涵盖了组织制备、切片通透化、探针设计以及信号放大等步骤。

摘要

近年来，许多高分辨率转录组学实验方案已在医学和生物学的多个领域中建立。然而，由于富含基质的组织（特别是肌腱）细胞数量少、每个细胞的RNA含量低且基质成分高，导致其分析难度较大，因而进展滞后。近期最重要的单细胞技术之一，是实现肌腱中基因表达水平的空间分析。这类RNA空间分析技术在肌腱研究中具有特别重要的意义，可用于定位新发现或未知的细胞亚群、验证单细胞RNA测序结果，并为单细胞RNA测序数据提供组织学背景信息。这些新方法将能够在单细胞水平上以极高的灵敏度分析细胞内的RNA，并检测单分子RNA靶标，从而有助于在分子层面深入表征肌腱，推动肌腱相关研究的发展。

在本方法学论文中，我们将重点介绍利用新型技术在组织学切片上分析空间基因表达水平的现有方法 原位 用于在单细胞水平上检测完整细胞内靶标RNA的杂交分析方法。首先，我们将重点介绍如何针对不同可用的检测方法制备肌腱组织，以及如何在无背景噪声干扰的情况下，实现高灵敏度和高特异性的靶标信号扩增。随后，本文将描述特定的通透化方法、不同的探针设计以及当前可用的信号放大策略。这些独特的单细胞分辨率下分析不同基因转录水平的方法，将有助于鉴定和表征多种动物模型及人类肌腱组织中年轻与衰老群体的肌腱细胞。该方法还可用于分析其他富含基质的组织（如骨骼、软骨和韧带）中的基因表达水平。

引言

肌腱是连接肌肉与骨骼并实现力传递的结缔组织¹。在发育过程中，轴向肌腱细胞来源于体节生骨节内的间充质细胞²；四肢肌腱来源于侧板中胚层；颅部肌腱则起源于颅神经嵴细胞系^3,4。肌腱的特征可通过表达转录因子 scleraxis 来识别⁵，尽管还有多个标志物在肌腱发育中发挥关键作用，包括tenomodulin、mohawk以及early growth response 1/2^6,7,8,9。

尽管目前已知的肌腱标志物较少，但总体而言，对肌腱进行更深入的表征仍然具有挑战性，因为肌腱包含的细胞跨越一系列生物力学特性的梯度。从肌腱-肌肉连接处、肌腱中段到更为钙化的附着点，肌腱细胞所处的细胞外基质在抗张性能上各不相同。由于肌腱必须承受软组织与硬组织之间力学强度差异所施加的张应力，因此肌腱内细胞的空间组织对其功能尤为重要。然而，目前对这些肌腱亚群细胞的了解仍然有限。

方案

所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及AAALAC指南进行。实验在马萨诸塞州总医院经批准的协议号#2013N000062下开展。本研究中使用了C57BL/6J小鼠（5周龄和P0阶段）。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 样品制备与固定

1. 将小鼠置于 CO₂ 麻醉室中实施安乐死，随后以颈椎脱位作为辅助安乐死方法。然后使用剪刀沿髋关节处剪下小鼠后肢¹²。将小鼠后肢放入闪烁计数瓶中，加入足量 4% 多聚甲醛（PFA）溶液完全浸没样本，在 4 °C 下固定 24 小时。
   注意：除 4% PFA 外，也可使用 10% 福尔马林进行固定。固定完成后，样本可保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，待后续处理。通过整体固定后肢，可维持肌腱张力，从而便于对附着点（enthesis）、肌腱中段或肌腱-肌肉连接处（myotendinous junction）进行观察分析。
2. 从闪烁计数瓶中移除 PFA 后，加入足量 1× PBS 浸洗样本，每次 10 分钟，共洗 3 次。随后将后肢样本浸入 0.5 M EDTA 溶液中，于 4 °C 条件下震荡孵育 1–2 周，每隔 2–3 天更换新鲜 EDTA 溶液。
3. 移除 EDTA 后，用 1× P....

结果

图1：使用RNAScope检测成年小鼠跟腱中的Poly A RNA表达。 使用商业化原位杂交（ISH）试剂盒成功标记小鼠跟腱中Poly A RNA的代表性图像（左图）。与DAPI共定位证实了探针的特异性（中图和右图），可用于排除背景噪声干扰。图像使用Leica SPE共聚焦显微镜在63倍放大下采集。比例尺 = 20 μm。缩写：ISH = 原位杂交；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。

讨论

在本文中，我们介绍了对现有原位杂交（ISH）工具进行的改进，使其能够在肌腱组织中以高特异性和高灵敏度进行应用。由于肌腱是一种基质高度密集的组织，通常需要对实验方案进行调整，以实现探针充分渗透并达到理想的特异性。这些针对肌腱组织的特定通透化方法和信号放大策略，对于提升本文所述ISH方案的有效性至关重要。若缺少这些步骤，探针将难以与肌腱中的RNA发生强效且特异的结合。

在RNAscope¹⁴中，必须对所使用的预处理缓冲液进行调整，以使该方案在肌腱组织中更有效地发挥作用。具体而言，使用TEG缓冲液作为预处理步骤可改善探针对靶RNA的可及性。除了TEG缓冲液外，蛋白酶IV处理时间也需超过标准时长，延长至45分钟至1小时。在HCR¹⁵中，洗涤步骤的时间已延长，并在RNA-FISH检测开始前增加了后固定步骤。后固定步骤包括在4%多聚甲醛（PFA）、PBT、蛋白酶K和乙酰化溶液中依次进行孵育。总体而言，这些改进有助于提高探针对肌腱RNA的可及性，并降低背景噪声^16<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M 三乙醇胺缓冲液
10% 甲醛溶液
10% Tween-20
20x 柠檬酸钠盐水缓冲液
4% PFA
ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V2	ACD	323100
乙酸酐
Axio Imager 显微镜	ZEISS
C57BL/J6 小鼠		JAX 编号：000664
盖玻片	Fisher	12-541-042
ddH2O
ETDA	Thermofisher	AM9262
EtOH
葡萄糖	VWR Chemicals BDH	BDH9230-500G
HCR RNA-FISH 试剂套装	Molecular Instruments Inc.
HybEZ II 杂交系统	ACD
Immedge 阻隔笔	Vector Laboratories	H4000
Leica SPE 共聚焦显微镜	Leica
Parafilm 封口膜	Fisher
磷酸盐缓冲液 (PBS, 1x)	Invitrogen	AM9625	将 10x PBS 用 milli-Q 水稀释得到 1x 溶液
蛋白酶 IV
蛋白酶 K	Roche	3115836001
RNAscope H2O2 和蛋白酶试剂	ACD	PN 322381	包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V3 中
RNAscope 多重荧光检测试剂盒	ACD	PN 323110	包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V2 中
RNAscope 靶标修复试剂	ACD	322000	包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V4 中
RNAscope 洗涤缓冲液	ACD	PN 310091	包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V5 中
RNAscope 探针稀释液	ACD	300041
载玻片架	StatLab	4465A
带盖染色缸	StatLab	LWS20WH
Superfrost Plus 显微载玻片	Fisher	1255015	经处理的带电载玻片
Tris-HCl
二甲苯	Sigma-Aldrich	534056-4L