תיוג אימונופלואורסצנטי בחלקי רקמת רירית האף של חולדות נזלת אלרגיות באמצעות בדיקה חיסונית צבעונית
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה אימונופלואורסצנטית צבעונית להערכת מודל החולדה של נזלת אלרגית.
Abstract
נזלת אלרגית (AR) היא מחלה דלקתית כרונית ולא זיהומית של רירית האף, המתווכת בעיקר על ידי אימונוגלובולין E ספציפי (IgE), המשפיעה על כ -10%-20% מאוכלוסיית העולם. בעוד צביעת אימונופלואורסנציה (IF) היא כבר מזמן טכניקה סטנדרטית לזיהוי ביטוי חלבונים ספציפיים למחלה, טכניקות IF קונבנציונליות מוגבלות ביכולתן לזהות את רמות הביטוי של שלושה חלבונים או יותר באותה דגימה. כתוצאה מכך, פותחו בשנים האחרונות טכניקות IF צבעוניות, המאפשרות תיוג סימולטני של מטרות מרובות בתאים או ברקמות.
פרוטוקול זה מספק סקירה מקיפה של תהליך הקמת מודל חולדה של AR, קבלת דגימות רירית האף, וההליכים הטכניים עבור immunofluorescence צבעוני. כל החולדות בקבוצת המציאות הרבודה הציגו תסמינים אופייניים כגון התעטשות, נזלת ואף מגרד, כאשר תצפיות התנהגותיות קיבלו ציון של ≥5 נקודות. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) חשפה ספירה מוגברת של תאים דלקתיים ושיבשה את שלמות רירית האף בקבוצת AR. אימונופלואורסצנטיות צבעונית (mIF) הדגימה ביטוי מוגבר של RORγt ו-TICAM-1, בעוד שביטוי Foxp3 ירד ברקמת רירית האף של חולדות AR.
Introduction
נזלת אלרגית (AR) היא מחלה דלקתית כרונית ולא זיהומית של רירית האף המתווכת בעיקר על ידי אימונוגלובולין E ספציפי (IgE)1,2. הוא מאופיין בתסמינים כגון התעטשות, נזלת, גודש באף וגירוד באף. עם התיעוש והעיור, השכיחות של AR עולה בהדרגה, ומשפיעה על כ 10%-20% מאוכלוסיית העולם1. טכניקת האימונופלואורסנציה (IF) היא שיטת צביעה פלואורסצנטית המשתמשת בתגובת קישור נוגדן-אנטיגן. ניתן להשתמש בו כדי לזהות ולכמת את רמות ההתפלגות והביטוי של חלבונים ספציפיים ברקמות או תאים ביולוגיים. במחקר AR, IF יכול לזהות בו זמנית מטרות מרובות, כולל ציטוקינים הקשורים ל- AR, תאים דלקתיים, קולטנים ועוד, מה שמקל על חקר פתוגנזה של AR וההשפעות של תרופות 3,4,5,6.
תהליך הצביעה האימונופלואורסצנטי (mIF) הצבעוני דומה מאוד ל-IF, עם תוספת של שלב פליטת נוגדנים במהלך כל סבב צביעה. שינוי זה מאפשר זיהוי סימולטני של סמנים ביולוגיים מרובים על אותו קטע רקמה באמצעות תיוג יחיד רציף וסבבים מרובים של צביעה מחדש. mIF מבוסס על הגברת אות טירמיד (TSA), המאפשר מחזורים חוזרים ונשנים של צביעה פלואורסצנטית TSA ושימוש בחימום מיקרוגל כדי להסיר נוגדנים תוך שמירה על אותות פלואורסצנטיים 7,8. בהשוואה ל- IF, mIF מציע מספר יתרונות: (1) הוא יכול לזהות אנטיגנים בעלי ביטוי חלש שמאתגרים לזיהוי עם IF 9,10 קונבנציונאלי; (2) הוא מספק צביעה באיכות גבוהה עם יחס אות לרעש משופר; (3) הוא מאפשר כימות של מבנים ספציפיים לרקמות ואזורי עניין11; (4) ריבוב מסלולים מרובים מנצל ביעילות רקמות ומשמר משאבים פתולוגיים מוגבלים12; (5) ניתוח רב-פרמטרים באמצעות mIF מציע תובנות עמוקות יותר על רקמות, וחושף מידע ביולוגי חבוי13.
בסך הכל, mIF מאפשר תצפית של ביטויי אנטיגן שונים והתפלגויות בתוך אותה דגימה, מה שמקל על המחקר של חלבוני המטרה. בעתיד, חוקרים המבקשים להבין את הביטוי וההפצה של חלבוני מטרה מרובים ימצאו בטכניקה זו בחירה בעלת ערך. מחקר זה מדגים את היישום של mIF להכתמת דגימות רירית האף מחולדות עם AR ומעריך את הקמתו של מודל חולדות של AR.
Protocol
Representative Results
Discussion
נזלת אלרגית (AR) היא מחלה דלקתית לא זיהומית של רירית האף הנובעת משילוב של גורמים סביבתיים וגנטיים. היא הפכה לדאגה בריאותית עולמית, משפיעה על יעילות העבודה, פוגעת באיכות החיים, פוגעת בשינה, בתפקוד הקוגניטיבי וגורמת לעצבנות ועייפות. מציאות רבודה משפיעה על 10%-20% מאוכלוסיית העולם¹ ונושאת עלויות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ’ואן (2021YJ0175).
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. 癌症研究. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. 癌症研究. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue – a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95 (2020).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. 癌症研究. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. 癌症研究. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
