本方案描述了一种可靠且高效的 体外 血脑屏障模型。该方法采用小鼠脑血管内皮细胞bEnd.3，并测量跨膜电阻力。
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摘要
摘要
血脑屏障（BBB）是一种由微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞构成的动态生理结构。通过协调调控有害物质的通透限制、营养物质的吸收以及脑内代谢产物的清除，血脑屏障在维持中枢神经系统稳态中起着至关重要的作用。构建 体外 血脑屏障模型是研究神经系统疾病病理生理机制和开发药理学治疗方法的重要工具。本研究描述了一种构建血脑屏障模型的实验流程。 体外 通过将 bEnd.3 细胞接种至 24 孔板的上室中构建单层血脑屏障细胞模型。为评估细胞屏障功能的完整性，采用常规上皮细胞伏特计记录正常细胞及 CoCl₂ 处理细胞的跨膜电阻。2实时监测缺氧诱导的细胞变化。我们预计上述实验将为创建有效方案提供有益思路 体外 血脑屏障模型及治疗中枢神经系统疾病药物
引言
血脑屏障（BBB）是血液循环与神经组织之间的一种独特生物界面，由血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、神经元及其他细胞结构组成1。该屏障严格调控血液与大脑之间离子、化学物质和细胞的流动，这种稳态保护神经系统组织免受毒素和病原体侵害，同时维持脑神经的正常功能2,3。维持血脑屏障的完整性可有效预防中枢神经系统疾病的发生与发展，例如神经功能障碍、水肿和神经炎症4。然而，血脑屏障独特的生理特性阻止了超过98%的小分子药物和100%的大分子药物进入中枢神经系统5。因此，在中枢神经系统药物研发过程中，提高药物穿越血脑屏障的能力对于实现治疗效果至关重要6,7。尽管通过计算机模拟筛选底物已显著提高了候选药物穿透血脑屏障的可能性，但仍需要可靠且经济的体外（in vitro）和体内（in vivo）血脑屏障模型，以满足科学研究的需求8。
一种快速且经济的高通量药物筛选技术是体外模型9
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方案
注意：将小鼠脑源性内皮细胞系3（bEnd.3）接种至24孔板的培养小室中，以构建一个简单的 体外 在特定培养基条件下建立的血脑屏障模型。使用TEER仪测量正常细胞和缺氧细胞的TEER值。图1 和 图2).
1. 溶液配制
- 准备含有 FBS（10%，v/v）、100 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素的 DMEM 细胞培养基（参见材料表）。
- 将 1.30 mg CoCl2 加入 100 µL DMSO 溶液中，配制 100 mM CoCl2 储存液。
注意：上述所有溶液均在 4 °C 条件下保存，使用前根据所需浓度进行稀释。 - 将 2 mL 次氯酸钠溶液加入 38 mL 双蒸水中，配制 5% 次氯酸钠溶液（v/v）。
2. 细胞培养与细胞活力
- 将 bEnd.3 细胞以 1 × 106 个细胞/mL 的密度接种于含 DMEM 培养基的培养皿（100 mm）中，总体积为 1 mL，在 37 °C、5% C....
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结果
该方案允许根据跨内皮电阻仪设定的参数记录细胞电阻值的变化。经不同浓度CoCl处理的bEnd.3细胞（活细胞数量）的存活率2 通过CCK-8法进行检测。CoCl引起的细胞损伤更显著。2 细胞活力降低。我们发现 300 µM CoCl的2 具有显著的细胞毒性 体外，该浓度用于后续实验（图3A）。通过监测bEnd.3细胞的生长电阻变化，我们发现细胞的TEER值在第5天开始趋于稳定th 天。通过添加诱导缺氧损伤 300 µM CoCl2 到6孔板的上室th 天，在12小时和24小时时间点，TEER值相较于对照组均显著降低（图3B）。细胞屏障的功能可通过TEER值间接评估，TEER值下降表明细胞屏障的破坏。该细胞屏障的TEER值 300 µM CoCl2 与对照组相比，在孵育24小时后，该组数量下降。图3C
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讨论
大脑是人体最发达的器官之一，控制着一系列复杂的生理过程，包括记忆、认知、听觉、嗅觉和运动27。同时，大脑也是人体最复杂且最容易发生疾病的器官之一。由于空气污染、饮食不规律等因素，中枢神经系统疾病的发病率正逐年上升27,28,29。有趣的是，某些中枢神经系统疾病（如中风、癫痫和阿尔茨海默病（AD））的发生与发展，与血脑屏障（BBB）的发育密切相关30,31,32。因此，针对大多数脑功能障碍相关疾病治疗的一个基本思路，可能是开发新的疗法或药物以维持血脑屏障功能的稳态。然而，由于血脑屏障具有疏水性及其独特的溶质转运机制，大多数药物难以进入脑实质发挥其关键作用14,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢国家自然科学基金（82274207 和 82104533）、宁夏回族自治区重点研发计划（2023BEG02012）以及成都中医药大学杏林学者科研提升项目（XKTD2022013）的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔Transwell板 | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75%乙醇 | 成都 chron 化学品有限公司 | 2023052901 | |
| 96孔板 | 广州捷博过滤科技有限公司 | 220412-078-B | |
| bEnd.3细胞 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | CL0049 | |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | 武汉博士德生物工程有限公司 | BG0025 | |
| 细胞培养皿（100 mm） | 浙江索尔法生命科学研究有限公司 | 1192022 | |
| 氯化钴（CoCl2） | Sigma | 15862 | |
| DMSO | 武汉博士德生物工程有限公司 | PYG0040 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（1×） | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| 胎牛血清 | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel（含IV型胶原） | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| 酶标仪 | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 软件 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| 青霉素-链霉素（100×） | 武汉博士德生物工程有限公司 | 17C18B16 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS, 1×） | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| 次氯酸钠 | 成都 chron 化学品有限公司 | 2022091501 | |
| 跨膜电阻测量仪 | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
参考文献
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).
- Bagchi, S., et al. I....
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