Summary

Высокоскоростной метод гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства везикул, полученных из эндосом

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

В данной работе мы описываем метод высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, как нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), которые имеют то же биологическое происхождение и сходную структуру, морфологию и белковый состав нативных внеклеточных везикул (ВВ).

Abstract

Внеклеточные везикулы (ВВ) привлекли значительное внимание в физиологических и патологических исследованиях, диагностике и лечении заболеваний; Тем не менее, их клиническая трансляция была ограничена отсутствием подходов к масштабному производству. Таким образом, этот протокол обеспечивает высокоскоростной метод гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, в качестве нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), полученных из эндосом, которые имеют примерно в 100 раз более высокий выход, чем традиционный метод ультрацентрифугирования. В этом методе магнитные наночастицы (MNP) интернализировались родительскими клетками посредством эндоцитоза и впоследствии накапливались в их эндосомах. Затем были собраны эндосомы с MNP, загруженные MNP, и очищены с помощью гипотонической обработки и магнитной сепарации. Высокоскоростной гомогенизатор был использован для разбиения эндосом, загруженных MNP, на монодисперсные нановезикулы. Полученные везикулы, полученные из эндосом, имеют одинаковое биологическое происхождение и структуру, характеризуются анализом отслеживания наночастиц, просвечивающим электронным микроскопом и вестерн-блоттингом. Их морфология и белковый состав аналогичны нативным ВВ, что указывает на то, что ЭМ потенциально могут служить недорогим и высокопродуктивным суррогатом нативных ВВ для клинических трансляций.

Introduction

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой небольшие везикулы, секретируемые почти всеми клетками с диапазоном размеров 30-150 нм, содержащие большое количество биологически активных веществ. В зависимости от исходной клетки ВВ демонстрируют высокую гетерогенность, обладая несколькими компонентами, специфичными для родительских клеток1. ВВ высвобождаются в жидкости организма и транспортируются в отдаленные участки, где они поглощаются клетками-мишенями для действия2, которое может быть использовано для доставки широкого спектра биологически активных молекул и лекарств для восстановления тканей, диагностики и лечения опухолей, а также иммуномодуляции 3,4. Однако другие биологические наночастицы (например, липопротеины) и нановезикулы (например, ВВ, полученные из неэндосомальных путей) с аналогичными биофизическими свойствами в жидкостях организма неизбежно влияют на выделение и очистку ВВ. На сегодняшний день ультрацентрифугирование остается золотым стандартом для изоляции ВВ, ибыли разработаны другие методы изоляции, включая центрифугирование с градиентом плотности сахарозы, ультрафильтрацию, осаждение полиэтиленгликоля, хроматографию и иммуномагнитную изоляцию шариков. В настоящее время узким местом, ограничивающим клиническую трансляцию и коммерциализацию терапевтических средств для лечения ВВ, является острая нехватка методов выделения, которые позволяют обеспечить высокомасштабируемую и воспроизводимую изоляцию ВВ 6,7,8. Традиционные методы выделения ВВ (например, ультрацентрифугирование и эксклюзионная хроматография) страдают от низкого выхода (1 x 107-1 x 108/1 x 106 клеток), длительного производственного цикла (24-48 ч), плохой воспроизводимости качества продукции и требуют дорогостоящего и энергоемкого производственного оборудования, которое не может удовлетворить текущий клинический спрос на электромобили6.

Имитаторы экзосом (ЭМ), синтетические суррогаты нативных электромобилей, привлекли важное внимание из-за их очень похожей структуры, функций и масштабируемости в производстве. Основным источником ЭМ является прямая экструзия целых родительских клеток с непрерывным секционированием9,10, демонстрирующая мощные биологические функции нативных ВВ11,12. Например, ЭМ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hUCMSCs), оказывают такое же ранозаживляющее действие, как и нативные ВВ, и более богаты белковым составом13. Несмотря на то, что ЭМ, полученные из цельных клеток, имеют биологическую сложность ВВ, их основным недостатком является гетерогенность продуктов, поскольку они неизбежно загрязняются различными клеточными органеллами и клеточным мусором. Анализ локализации белков также показал, что ЭМ, полученные в результате экструзии цельных клеток, содержат много неспецифичных для ВВ белков из митохондрий и эндоплазматического ретикулума13. Кроме того, большинство методов производства ЭМ по-прежнему требуют ультрацентрифугирования, что является очень трудоемким и энергоемкимпроцессом14. Принимая во внимание тот факт, что экзосомы происходят исключительно из клеточных эндосом, мы предположили, что биоинженерные нановезикулы, полученные из эндосом, могут лучше повторять биологическую гомологию между экзосомами и ЭМ по сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя ЭМ, полученными из клеточных мембран, полученными методом экструзии цельных клеток14. Тем не менее, производство нановезикул, полученных из эндосом, затруднено из-за отсутствия жизнеспособных подходов.

Клинические исследования проводились с использованием ВВ в качестве суррогата бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств для лечения различных заболеваний. Например, ВВ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, использовались для лечения тяжелой пневмонии, вызванной COVID-19, и достигли многообещающих результатов. Недавно генетически модифицированные электромобили, несущие белки CD24, также продемонстрировали мощные терапевтические преимущества для лечения пациентов с COVID-1915,16. Тем не менее, клинические требования к терапии ВВ все еще не могут быть удовлетворены традиционными методами изоляции из-за низкой производительности и стоимости. В этом исследовании сообщается о крупномасштабном производстве нановезикул, полученных из эндосом, с помощью высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации. Он использует эндоцитозный путь MNP для выделения эндосом, загруженных MNP, с помощью магнитной сепарации с последующей высокоскоростной гомогенизацией для формирования эндосом в монодисперсные нановезикулы. Поскольку типы эндосом, собранных в рамках этого протокола, разнообразны, все еще необходимы дальнейшие углубленные исследования для установления надлежащей производственной практики (GMP) в отрасли. Этот новый подход к ЭМ-подготовке является более эффективным по времени (5 минут высокоскоростной гомогенизации) для получения нановезикул, гомологичных нативным ВВ. Он производит экспоненциально больше везикул из тех же количеств клеток, чем ультрацентрифугирование, которое в целом может быть применено к различным типам клеток.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема метода показана на рисунке 1. 1. Подготовка и изоляция ЭМ Клеточная интернализация MNPКлеточная культураСуспендировать 1 × 106 мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крысы (BMSC), 293Т-клеток или клеток эпит…

Representative Results

Рабочий процесс получения ЭМ методом высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации показан на рисунке 1. Клетки интернализируют 10-нм полилизин-модифицированные ионы, которые специфически накапливаются в эндосомах посредством эндоцитоза (ри…

Discussion

Являясь суррогатом бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств, ВВ еще не оправдали своих клинических ожиданий, и основным препятствием является отсутствие масштабируемых и воспроизводимыхметодов производства и очистки. Поэтому в качестве аналогов В…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают использование приборов в Центре совместного использования контрольно-измерительных приборов в Институте фундаментальной медицины и рака (IBMC) Китайской академии наук. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC; 82172598), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян, Китай (LZ22H310001), Проектом 551 по подготовке кадров в области здравоохранения Комиссии по здравоохранению провинции Чжэцзян, Китай, Исследовательским проектом по сельскохозяйственному и социальному развитию Муниципального научно-технического бюро Ханчжоу (2022ZDSJ0474) и Междисциплинарным исследовательским грантом Цяньтан.

Materials

Annexin antibody ABclonal A11235 Western blotting
BCA assay kit Beyotime P0012 Protein concentration assay
Calnexin GeneTex HL1598 Western blotting
CD63 antibody ABclonal A19023 Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP Beyotime P0013 Western blotting
Centrifuge Beckman Allegra X-30R Cell centrifuge
CO2 incubator Thermo Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy NIKON A1 HD25 Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x) GIBCO C11995500BT Cell culture
Dynamic light scattering (DLS) Malvern Zetasizer Nano ZS ZEN3600 Diameter analysis
Electric glass homogenizer SCIENTZ(Ningbo, China) DY89-II Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS system Bioscience EXO-FBS-50A-1 Cell culture
High-speed homogenizer SCIENTZ(Ningbo, China) XHF-DY High-speed homogenization
Magnetic grate Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) NA Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) Mag1100-10 Cell culture
Potassium chloride Aladdin 7447-40-7 Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail Beyotime P1030 Proteinase inhibitor
Sodium citrate Aladdin 7447-40-7 Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM) JEOL JEM-2100plus Morphology image
Ultracentrifuge Beckman Optima XPN-100 Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers Particle Metrix PMX120 Nanoparticle tracking analysis

References

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
  2. Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
  3. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
  4. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  5. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  6. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  7. Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
  8. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
  9. Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
  10. Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
  11. Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
  12. Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
  13. Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
  14. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
  15. Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
  16. Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
  17. Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
  18. Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
  19. Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
  20. Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).

Play Video

Cite This Article
Wang, D., Yao, S., Guo, P. A Magnetic Separation-Assisted High-Speed Homogenization Method for Large-Scale Production of Endosome-Derived Vesicles. J. Vis. Exp. (203), e66021, doi:10.3791/66021 (2024).

View Video