患者来源的肿瘤类器官是基础与转化研究中一种复杂的模型系统。本文详细介绍了利用多重荧光活细胞成像技术，对不同类器官表型进行同步动力学评估的方法。
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方法文章
用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
癌症患者来源类器官（PDO）模型是一种多功能研究体系，相较于癌细胞系，能更真实地模拟人类疾病。PDO模型可通过将患者肿瘤细胞在细胞外基底膜提取物（BME）中培养，并以三维半球状形式接种来建立。然而，市面上许多为单层培养中表型检测而优化的试剂通常与BME不兼容。本文介绍一种利用自动化活细胞成像系统接种PDO模型并评估药物效应的方法。此外，我们应用了适用于动力学检测的荧光染料，以同时定量细胞健康状态和细胞凋亡。图像采集可自定义为在数天内按固定时间间隔进行。用户可分析单个Z平面图像，或对多个焦平面连续图像生成的Z投影进行分析。通过掩膜（masking）技术，可计算特定感兴趣参数，如PDO数量、面积和荧光强度。我们提供了概念验证数据，展示了细胞毒性药物对细胞健康、凋亡及存活率的影响。该自动化动力学成像平台可进一步拓展至其他表型读出指标，以深入理解各类治疗手段在癌症PDO模型中的作用效果。
引言
患者来源的肿瘤类器官（PDOs）正迅速成为研究癌症发生发展及治疗反应的有力模型系统。PDOs 是一种三维（3D）细胞培养系统，能够重现原发肿瘤复杂的基因组特征和组织结构1,2。与传统的永生化癌细胞系二维（2D）培养相比，PDOs 能够捕捉并维持肿瘤内异质性3,4，使其成为机制研究和转化研究的重要工具。尽管 PDOs 正日益成为广受欢迎的模型系统，但目前可用于 PDO 培养体系、且与之兼容的商业化试剂和细胞效应分析方法仍十分有限。
目前缺乏用于分析治疗反应细微变化的可靠方法，这阻碍了临床转化。在三维培养中，细胞健康检测试剂的金标准——CellTiter-Glo 3D，利用ATP水平作为细胞活力的判断依据5,6。尽管该试剂适用于终点检测，但仍存在若干局限性，其中最显著的是检测完成后样本无法用于其他用途。
活细胞成像是一种复杂的动力学显微技术，当与荧光试剂结合使用时，能够在PDO模型中定量检测多种细胞健康指标，包括细胞凋亡7
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方案
本研究使用的人类肿瘤标本相关研究已通过爱荷华大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准（方案编号：201809807），并依照1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版所规定的伦理标准进行。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。纳入标准包括确诊为癌症且有可获取的肿瘤标本。
1. 在96孔板中接种完整的PDO
- 准备试剂。
- 将96孔板在37 °C预热过夜，并在4 °C下解冻基底膜提取物（BME）过夜。
- 配制适用于目标癌症类型培养的完整类器官培养基。本文所示实验所用的具体培养基详见补充表1。
注意：不同肿瘤类型可能需要调整培养基成分。例如，妇科肿瘤的类器官培养基需添加100 nM雌二醇13。配制好的培养基在4 °C可稳定保存1个月。如需长期保存，将培养基分装至50 mL离心管中，于-20 °C储存。
- 分别准备4 °C和37 °C的两份类器官培养基。例如，若在96孔板中接种60个孔，则使用6 mL预热的类器官培养基和150 µL冰上预冷的类器官培养基。
- 配制类器官洗涤缓冲液：在1x PBS中添加10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA和10 µM Y-27632。4 °C保存。
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结果
我们的目标是证明利用多重活细胞成像评估类器官药物治疗反应的可行性。概念验证实验在两个独立的子宫内膜癌类器官（PDO）模型ONC-10817和ONC-10811中进行（见 补充图1 和 补充图2 对于ONC-10811数据）。在凋亡诱导剂星形孢菌素处理下，通过动力学方法监测细胞凋亡（annexin V染色）和细胞毒性（Cytotox Green摄取）。具体而言，将PDO细胞接种于96孔板中，加入Annexin V Red和Cytotox Green染料进行处理，随后置于 37 °C 孵育器中过夜，如图所示 图1. 我们在两个独立的PDO模型中证实，Annexin V和Cytotox Green染料处理无毒性（补充图2）。次日，使用浓度递增的星形孢菌素（0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、500 nM）处理PDO。随后，在Gen5软件中建立实验方案，设定实验持续5天，每6小时成像一次。数据采用Gen5软件中的细胞分析功能进行分析，具体方法见方案第4节。.......
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讨论
由于能够反映细胞的响应和行为，PDO 培养物正成为一种日益流行的体外模型系统2。在 PDO 的生成、培养和扩增技术方面已取得显著进展，但针对治疗反应的分析方法却相对滞后。市面上可获得的三维细胞活力检测试剂盒均为裂解终点法检测，无法获取潜在的重要动力学响应数据，并且限制了后续采用其他方法进行的分析8。近期研究开始应用活细胞成像技术来评估 PDO 模型中的药物反应。本文中，我们提出一种利用多重荧光活细胞成像技术随时间评估 PDO 治疗反应的方法。通过荧光染料的多重标记，可同时定量多种不同的细胞反应。除了细胞凋亡和细胞毒性外，我们预计该方法在未来的研究中还可进一步拓展，用于检测 PDO 中的其他表型效应。
本方案旨在获取在96孔板中以穹顶状接种的PDO（类器官）的动力学明场和荧光图像。关键步骤包括：1）接种，2）加入染料和药物处理，3）设定成像参数，4）动力学图像采集完成后进行图像预处理与分析，以及5）将数据导出至其他统计软件进行进一步分析（图1
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披露
KWT 是 Immortagen 公司的共同所有人。CJD 是安捷伦（Agilent）的员工。JSdB 曾在阿斯利康（Astra Zeneca）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Bioxcel Therapeutics、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、卫材（Eisai）、基因泰克/罗氏（Genentech/Roche）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、Harpoon、ImCheck Therapeutics、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（Merck Sharp & Dohme）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、辉瑞（Pfizer）、凯杰（Qiagen）、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、泰尔茂（Terumo）和 Vertex Pharmaceuticals 的顾问委员会任职并收取费用；是英国癌症研究所（Institute of Cancer Research, ICR）的员工，该机构已从阿斯利康（AZ）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、基因泰克（Genentech）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（MSD）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、辉瑞（Pfizer）和 Vertex 等公司获得其研究工作的资助或其他支持，且该机构在阿比特龙、DNA 修复缺陷型癌症中的 PARP 抑制以及 PI3K/AKT 信号通路抑制剂方面拥有商业利益（JSdB 本人无个人收入）；被列为强生公司提交的专利 8 822 438 的发明人之一，该专利涉及醋酸阿比特龙与皮质类固醇联合使用的方案，但本人无经济利益；曾担任多项由企业资助的临床试验的首席研究员（CI/PI）；同时是英国国家卫生研究所（National Institute for Health Research, NIHR）高级研究员。其他作者均无潜在利益冲突需披露。
致谢
我们感谢爱荷华大学组织采集核心实验室及Kristen Coleman博士提供患者肿瘤标本，同时感谢妇产科的Sofia Gabrilovich博士在PDO模型构建过程中提供的协助。我们还感谢Agilent公司（美国）的Valerie Salvatico博士对本文稿的审阅与关键性分析。本研究得到以下基金支持：NIH/NCI CA263783和DOD CDMRP CA220729P1（资助KWT）；癌症研究英国（Cancer Research UK）、前列腺癌英国（Prostate Cancer UK）、前列腺癌基金会（Prostate Cancer Foundation）以及医学研究理事会（Medical Research Council）（资助JSdB）。资助方未参与实验设计、数据分析或发表决定。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Dot Scientific Inc | 1008113 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Sarstedt | 62.554.100 | |
| 554 NM LED 模块 | Agilent | 1225012 | |
| 96 孔板 | Corning Costar | 3596 | 预热至 37 °C |
| 96 孔板 | Agilent | 204626-100 | 预热至 37 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | 终浓度为 500 nM（类器官培养基组分） |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634-010 | 类器官培养基组分 |
| B27 补充剂 | Gibco | 17504044 | 终浓度为 1x（类器官培养基组分） |
| BioTek BioSpa 8 自动化培养箱 | Agilent | BIOSPAG-SN | 台式培养箱；BioSpa OnDemand 调度软件与 Gen5 通信，用于在 BioSpa 与 Cytation 5 之间转移培养板以进行成像（本方案使用版本 1.01.10） |
| BioTek Cytation 5 细胞成像多功能读板仪 | Agilent | CYT5PW-SN | 读板仪；本设备使用 Gen5 软件（本方案使用版本 3.12.08） |
| Cultrex UltiMatrix 低生长因子基底膜提取物 | R&D Systems | BME001-10 | |
| 盐酸柔红霉素 | Sigma-Aldrich | S3035 | 用 DMSO 重悬 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Fisher | AM9260G | |
| 福斯科林 | Tocris | 1099 | 终浓度为 10 µM（类器官培养基组分） |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 终浓度为 1x（类器官培养基组分） |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 终浓度为 10 mM（类器官培养基组分） |
| 人 EGF，无动物源重组蛋白 | Gibco | AF-100-15-1MG | 终浓度为 0.5 ng/mL（类器官培养基组分） |
| 人 FGF-10 重组蛋白 | Gibco | 100-26-1MG | 终浓度为 10 ng/mL（类器官培养基组分） |
| 人 R-Spondin 1 重组蛋白 | Gibco | 120-38-5UG | 终浓度为 250 ng/mL（类器官培养基组分） |
| 氢化可的松储备液 | StemCell Technologies | 7926 | 终浓度为 500 ng/mL（类器官培养基组分） |
| 成像滤光模块 - GFP | Agilent | 1225101 | |
| 成像滤光模块 - TRITC | Agilent | 1225125 | |
| 成像 LED GFP/CFP | Agilent | 1225001 | |
| Incucyte Annexin V 红色染料 | Sartorius | 4641 | 用类器官培养基重悬 |
| Incucyte Cytotox 绿色染料 | Sartorius | 4633 | DMSO 溶液 |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A7250 | 终浓度为 1.25 mM（类器官培养基组分） |
| Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI 染色液 | Fisher-Scientific | 13366169 | 按 1:50 体积添加 |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | 终浓度为 10 mM（类器官培养基组分） |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | 终浓度为 100 ng/mL（类器官培养基组分） |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 终浓度为 10 单位/mL（类器官培养基组分） |
| 磷酸盐缓冲液 (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | 终浓度为 100 µg/mL（类器官培养基组分） |
| 重组人 Heregulinβ-1 | Pepro Tech | 100-03 | 终浓度为 37.5 ng/mL（类器官培养基组分） |
| 链霉菌来源的星形孢菌素溶液 | Sigma-Aldrich | S6942 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| Y-27632，CAS 331752-47-7 | Sigma-Aldrich | 688000 | 终浓度为 5 µM（类器官培养基组分） |
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E2758 | 终浓度为 100 nM（类器官培养基组分） |
参考文献
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
- Sachs, N., et al.
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