该方案描述了一种高效且可靠的方法，用于定量分析目的基因的 poly(A) 尾长度 果蝇 神经系统，可轻松适用于其他物种的组织或细胞类型。
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本文内容
摘要
摘要
多聚腺苷酸化是一种关键的转录后修饰过程，可在mRNA分子的3'端添加多聚(A)尾。多聚(A)尾的长度受到细胞过程的严格调控。mRNA多聚腺苷酸化的失调与异常基因表达以及多种疾病相关，包括癌症、神经系统疾病和发育异常。因此，理解多聚腺苷酸化的动态变化对于揭示mRNA加工和转录后基因调控的复杂性至关重要。
本文介绍了一种用于测定从RNA样本中分离出的poly(A)尾长度的方法 果蝇 幼虫大脑和 黑腹果蝇 Schneider S2 细胞。我们采用了鸟苷酸/肌苷酸（G/I）加尾法，该方法利用酵母多聚腺苷酸聚合酶在 mRNA 的 3' 端酶促添加 G/I 残基。这一修饰可保护 RNA 的 3' 端免受酶解降解。随后使用通用反义引物对具有完整长度多聚(A)尾的 RNA 进行逆转录。接着，采用针对目的基因的基因特异性寡核苷酸与用于逆转录的通用序列寡核苷酸进行 PCR 扩增。
这将扩增出包含目的基因多聚腺苷酸尾的PCR产物。由于多聚腺苷酸化并非均一的修饰过程，会产生长度不同的尾部结构，因此PCR产物具有多种大小，从而在琼脂糖凝胶电泳中呈现弥散条带模式。最后，对PCR产物进行高分辨率毛细管凝胶电泳分析，并根据多聚腺苷酸尾PCR产物与基因特异性PCR产物的大小进行定量。该技术为分析多聚腺苷酸尾长度提供了一种简单且可靠的工具，有助于我们更深入地理解mRNA调控的复杂机制。
引言
大多数真核生物mRNA在细胞核内由经典的多聚腺苷酸聚合酶（poly(A)聚合酶）在其3′末端通过添加非模板依赖的腺苷酸进行转录后多聚腺苷酸化。完整的poly(A)尾在mRNA的整个生命周期中至关重要，因其对mRNA的核输出必不可少1，可促进与poly(A)结合蛋白的相互作用从而增强翻译效率2，并赋予mRNA抵抗降解的能力3。在某些情况下，poly(A)尾还可由非经典的poly(A)聚合酶介导在细胞质中进一步延长4。在细胞质中，poly(A)尾的长度动态变化，并影响mRNA分子的寿命。目前已知多种聚合酶和去腺苷酸化酶参与调控poly(A)尾的长度5,6,7。例如，poly(A)尾的缩短与翻译抑制相关，而poly(A)尾的延长则增强翻译活性8,9。
越来越多的基因组学研究揭示了poly(A)尾长度在真核生物多个生物学过程中的基础性作用，包括生殖细胞发育、早期胚胎发育、学习与记忆相关的神经元突....
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方案
1. 饲养与筛选 果蝇 幼虫
- 在25 °C的加湿培养箱中，将果蝇品系（w1118，野生型）维持/培养于标准果蝇培养基上。
- 在产卵后72小时，挑选10只游走期3龄幼虫。
- 将幼虫放入一个35 mm的空培养皿中，用镊子将幼虫转移至含有自来水的新培养皿中，轻轻清洗。重复此步骤2次，以去除残留的食物。
2. 从大脑中分离 果蝇 幼虫（图1)
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结果
在此，我们分析了 poly(A) 尾的长度 Dscam1 和 GAPDH 从 果蝇 幼虫大脑（图4). 分离的RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。在约600个核苷酸大小处出现单一RNA条带，表明RNA样品完整图 2A）。RNA经过G/I加尾处理，并使用Agilent 2100生物分析仪进行高分辨率毛细管电泳。利用Agilent 2100 Expert软件导出凝胶图像，并进行相应拼接。来自PCR的产物 GAPDH 和 Dscam1 特异性基因引物对显示出清晰的单一条带，而基因特异性引物与通用引物组合则呈现出明显的弥散条带模式（图4A 和 表1），表明 poly(A) 长度存在差异 GAPDH 和 Dscam1 mRNAs。在 图4B，采用涂片分.......
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讨论
在本实验方案中，我们描述了从徘徊期3rd 龄幼虫阶段解剖Drosophila幼虫脑组织的技术，以及从Drosophila S2细胞进行样品制备的方法。由于mRNA具有不稳定性，样品收集过程需要格外谨慎。在幼虫脑组织解剖过程中，应避免在分离时损伤脑组织，并且组织不应长时间保存在溶液中。每次解剖操作时间应控制在8–10分钟内。此外，在解剖液中添加RNase抑制剂可能有助于保护RNA完整性。对于S2细胞的培养与转染操作，所有步骤均应在超净工作台内进行。
RNA 提取步骤需要额外注意。我们建议使用经过 RNase 去除溶液预处理的层流式洁净工作空间。除了 RNA 产量外，还必须检测 RNA 的完整性，以确保样本在解剖和提取过程中未发生降解。RNA 完整性可通过变性琼脂糖凝胶电泳进行可视化分析。Drosophila 的总 RNA 呈现单一的条带模式，因为其 28S rRNA 会解离成两个大小相等的亚基，与 18S rRNA 共迁移25。当使用单链 RNA ladder .......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所资助项目R01NS116463（资助对象：J.K.）以及内华达大学里诺分校的细胞与分子成像核心设施支持，该核心设施由美国国立卫生研究院资助项目P20GM103650支持，并用于本研究所报告的科研工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent 高灵敏度 DNA 检测试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 软件 2100 Expert 免费下载试用版 | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-低分子量 DNA 标准 Marker | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| 焦碳酸二乙酯 (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA 染料（紫色上样缓冲液 (6x)） | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 细胞系 | Drosophila Genomics Resource Center 货号 #181 | ||
| Drosophila Schneider’s 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| 溴化乙锭 | Genesee scientific | 20-276 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 镊子 Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| 无核酸酶水 | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| 多聚(A)尾长度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler 低分子量 RNA 标准 Marker | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA 上样缓冲液 (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA 微量提取试剂盒 | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA 小量提取试剂盒 | Zymoresearch | R1055 | |
| 剪刀 - Vannas 弹簧剪 - 2.5 mm 刃口 | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision 琼脂糖片剂 | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-乙酸-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
参考文献
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).....
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