从人类多能干细胞（hPSC）中诱导生成肠神经系统（ENS）谱系细胞，为研究ENS的发育与疾病以及再生医学应用提供了可扩展的细胞来源。本文详细描述了一种 体外 利用化学成分明确的培养条件从人多能干细胞分化出肠神经元的方案
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本文内容
摘要
摘要
人类肠神经系统（ENS）是一个由多种胶质细胞和神经元细胞构成的庞大网络，具有显著的神经递质多样性。ENS 控制肠道蠕动、酶的分泌以及营养物质的吸收，并与免疫系统和肠道微生物组相互作用。因此，ENS 的发育性或获得性缺陷可导致多种人类疾病，并可能参与帕金森病症状的发生。由于动物模型系统的局限性以及获取原代组织的困难，对人类 ENS 的研究面临重大的实验挑战。本文提供了一项详细的方案，用于高效 体外 利用定义明确的培养条件，从人多能干细胞（hPSC）诱导生成肠神经系统谱系。本方案在15天内将hPSC定向分化为肠源性神经嵴细胞，并在30天内获得多种功能性的肠神经元亚型。该平台为发育研究、疾病建模、药物筛选及再生医学应用提供了可扩展的资源。
引言
肠神经系统（ENS）是周围神经系统中最大的组成部分。ENS 包含超过 4 亿个位于胃肠道内的神经元，几乎控制着肠道的所有功能1对肠神经系统（ENS）发育、功能及其在肠神经病变中缺陷的分子机制的理解，需要获得可靠且真实的肠神经元来源。人类原代组织的获取受限，而动物模型在许多肠神经病变中无法重现关键的疾病表型。人类多能干细胞（hPSC）技术已被证明在提供所需细胞类型方面具有极大优势，尤其是对于那些难以从原代组织中分离的细胞类型，可实现无限供应。2,3,4,5,6,7. 本文详细介绍了逐步且稳健的方法 体外 从人多能干细胞（hPSCs）获取肠神经元培养物的方法。这些可扩增的hPSC来源培养物为发育研究、疾病建模和高通量药物筛选提供了新途径，并可为再生医学提供可移植细胞。
肠神经元谱系起源于胚胎发生过程中肠神经系统（ENS）发育通路的神经嵴（NC）细胞。在胚胎中，神经嵴细胞出现在折叠的神经板边缘。这些细胞增殖、迁移，并分化为多种....
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方案
1. 培养基制备
注意：本方案中提到的浓度均为培养基组分的终浓度。所有培养基均须在超净工作台中无菌条件下配制，并于4 °C避光保存。请在2周内使用完毕。
- 人多能干细胞维持培养基：将无饲养层人多能干细胞维持培养基添加剂（20 µL/mL）与其基础培养基混合。
- 培养基A：将骨形态发生蛋白4（BMP4；1 ng/mL）、SB431542（10 μM）和CHIR99021（600 nM）加入分化基础培养基中。
- 培养基B：将SB431542（10 μM）和CHIR99021（1.5 μM）加入分化基础培养基中。
- 培养基C：将SB431542（10 μM）、CHIR99021（1.5 μM）和视黄酸（RA，1 μM）加入分化基础培养基中。
- 神经嵴完全培养基（NCC培养基）：将FGF2（10 ng/mL）、CHIR99021（3 μM）、N2添加剂（10 μL/mL）、B27添加剂（20 μL/mL）、L-谷氨酰胺添加剂（10 μL/mL）和MEM非必需氨基酸（MEM NEAAs，10 μL/mL）加入神经基础培养基（neurobasal medium）中。
- 肠神经嵴细胞培养基（ENC培养基）：将GDNF（10 ng/mL）、抗坏血酸（100 μM）、N2添加剂（10 μL/mL）、B27添加剂（20 μL/mL）、L-谷氨酰胺添加剂....
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结果
该方案提供了一种在化学成分明确的培养条件下，由人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肠神经嵴及肠神经元的方法（图1A- B）。高质量神经元的生成依赖于高效的肠神经嵴诱导步骤。可通过观察游离球体的形态来直观评估，这些球体应呈圆形、表面光滑，直径约为0.1–0.4 mm，如图所示。 图1C这些类球体还应表达神经嵴标志物SRY-盒转录因子10（SOX10）。17,18，如图所示 图1D在肠神经元诱导阶段，神经突起最早可在第25-30天可见图1E）。然而，在分化效率较低且含有不期望的间充质细胞污染的情况下，这一过程可能会延迟。人类肠神经系统由表达不同神经递质的多种神经元组成。这种异质性在体外分化模型中得以重现。 体外 根据所提供的方案，可通过细胞.......
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讨论
此处所述的分化方案提供了一种可靠的方法 体外 在30-40天内从人多能干细胞获得肠神经元的方法（图1E) 以及在较老的培养物中表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和 SOX10 的肠胶质细胞> 第55天13,14,19,22这些神经元和胶质细胞是通过将人多能干细胞（hPSCs）逐步分化为迷走神经和肠神经嵴细胞，进而诱导为肠神经元和胶质细胞前体而获得的。13,14神经嵴细胞表达神经嵴标志物，即转录因子 AP-2 alpha 和 AP-2 beta，分别为 TFAP2A 和 TFAP2B21我们先前已证明，CD49 可作为标记物用于指示人多能干.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了加州大学旧金山分校（UCSF）突破性生物医学研究计划和桑德勒基金会的资助，以及美国出生缺陷基金会资助项目（编号：1-FY18-394）、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（1DP2NS116769-01）、NIH主任创新者奖（DP2NS116769）（授予F.F.）以及美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助项目（R01DK121169）（授予F.F.）。H.M. 获得了拉里·L·希尔布洛姆基金会博士后奖学金、NIH T32-DK007418 博士后奖学金以及加州大学旧金山分校（UCSF）突破性生物医学研究计划独立博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27添加剂（无血清，不含维生素A） | Gibco | 12587-010 | |
| 基底膜基质，Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| 细胞培养离心机 | Eppendorf，型号 5810R | 02262501 | |
| 细胞解离液，Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| 锥形管 | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| 分化基础培养基，Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 无谷氨酰胺 | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| 无饲养层hPSC维持培养基，Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| 纤连蛋白 | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 1475 | |
| 人多能干细胞，H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| 具有湿度、温度和CO2控制的培养箱 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| 倒置显微镜 | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| 层流罩 | Thermo Fisher Scientific | 1300系列 II级A2型 | |
| 层粘连蛋白 | Cultrex | 3400-010 | |
| L-谷氨酰胺添加剂，Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM非必需氨基酸 | Corning | 25-025-CI | |
| 多孔板，Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2添加剂 | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal培养基 | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS（无钙镁） | Life Technologies | 10010023 | |
| 移液器吸头填充器 | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| 移液器吸头 | USA scientific | 1111-2830 | |
| 移液器 | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| 聚合物盖玻片底成像板，ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| 台盼蓝染色液，0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 超低吸附板 | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632二盐酸盐 | R&D systems | 1254 |
参考文献
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol C....
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重印与许可
