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Bioengineering

जटिल 3 डी झरझरा मीडिया में गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए 3 डी प्रिंटिंग बैक्टीरिया

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66166
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2
1Department of Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 2Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Summary

यह प्रोटोकॉल जटिल 3 डी झरझरा हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में उनकी गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए बैक्टीरियल कॉलोनियों के त्रि-आयामी (3 डी) मुद्रण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है जो पारंपरिक तरल संस्कृतियों या पेट्री डिश की तुलना में उनके प्राकृतिक आवासों के समान हैं।

Abstract

बैक्टीरिया जटिल त्रि-आयामी (3 डी) झरझरा वातावरण, जैसे जैविक ऊतक और जैल, और उपसतह मिट्टी और तलछट में सर्वव्यापी हैं। हालांकि, पिछले काम के बहुमत थोक तरल पदार्थ में या फ्लैट सतहों पर कोशिकाओं के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है, जो पूरी तरह से कई प्राकृतिक जीवाणु आवासों की जटिलता recapitulaate नहीं है. यहां, ज्ञान में इस अंतर को बैक्टीरिया के 3 डी-प्रिंट घने कालोनियों को जाम दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में एक विधि के विकास का वर्णन करके संबोधित किया जाता है। इन मैट्रिसेस में ट्यून करने योग्य ताकना आकार और यांत्रिक गुण होते हैं; वे शारीरिक रूप से कोशिकाओं को सीमित करते हैं, इस प्रकार उन्हें 3 डी में समर्थन करते हैं। वे वैकल्पिक रूप से पारदर्शी हैं, इमेजिंग का उपयोग करके अपने परिवेश के माध्यम से फैलने वाले बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देते हैं। इस सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, यहां, इस प्रोटोकॉल की क्षमता 3 डी प्रिंटिंग और इमेजिंग गैर-मोटाइल और मोटाइल विब्रो कोलेरा, साथ ही गैर-मोटाइल एस्चेरिचिया कोलाई द्वारा अलग-अलग अंतरालीय छिद्र आकारों के साथ जाम दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में प्रदर्शित की जाती है।

Introduction

बैक्टीरिया अक्सर विविध, जटिल 3 डी झरझरा वातावरण में निवास करते हैं, जो आंत और फेफड़ों में म्यूकोसल जैल से लेकर जमीन में मिट्टी तक 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. इन सेटिंग्स में, गतिशीलता या विकास के माध्यम से जीवाणु आंदोलन इस तरह के बहुलक नेटवर्क या ठोस खनिज अनाज की पैकिंग के रूप में आसपास की बाधाओं, कोशिकाओं की क्षमता को प्रभावित उनके वातावरण26 के माध्यम से फैल करने के लिए प्रभावित किया जा सकता है, पोषक तत्व स्रोतों का उपयोग, नए इलाके उपनिवेश, और सुरक्षात्मक बायोफिल्म समुदायों27 फार्म. हालांकि, पारंपरिक प्रयोगशाला अध्ययन आमतौर पर अत्यधिक सरलीकृत ज्यामिति को नियोजित करते हैं, तरल संस्कृतियों में या सपाट सतहों पर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि ये दृष्टिकोण सूक्ष्म जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, लेकिन वे प्राकृतिक आवासों की जटिलता को पूरी तरह से पुन: व्यवस्थित नहीं करते हैं, जिससे वास्तविक दुनिया की सेटिंग्स में किए गए मापों की तुलना में विकास दर और गतिशीलता व्यवहार में नाटकीय अंतर होता है। इसलिए, बैक्टीरियल कॉलोनियों को परिभाषित करने और 3 डी झरझरा वातावरण में उनकी गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए एक विधि उनके कई प्राकृतिक आवासों के समान गंभीर रूप से आवश्यक है।

एक अगर जेल में कोशिकाओं inoculating और फिर आंख से या एक कैमरा का उपयोग कर उनके मैक्रोस्कोपिक प्रसार कल्पना इस पूरा करने के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करता है, के रूप में पहली बार 193628 में Tittsler और Sandholzer द्वारा प्रस्तावित. हालांकि, यह दृष्टिकोण कई प्रमुख तकनीकी चुनौतियों से ग्रस्त है: (1) जबकि ताकना आकार, सिद्धांत रूप में, अगारोज एकाग्रता को अलग करके भिन्न हो सकता है, ऐसे जैल की छिद्र संरचना खराब रूप से परिभाषित की जाती है; (2) प्रकाश प्रकीर्णन इन जैल को अशांत होने का कारण बनता है, जिससे उच्च रिज़ॉल्यूशन और निष्ठा के साथ व्यक्तिगत पैमाने पर कोशिकाओं की कल्पना करना मुश्किल हो जाता है, खासकर बड़े नमूनों में; (3) जब अगर एकाग्रता बहुत बड़ी है, सेल प्रवास जेल के शीर्ष फ्लैट सतह तक ही सीमित है; (4) इस तरह के जैल की जटिल रियोलॉजी अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामिति के साथ इनोकुला को पेश करना चुनौतीपूर्ण बनाती है।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, पिछले काम में, दत्ता की प्रयोगशाला ने दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस का उपयोग करके एक वैकल्पिक दृष्टिकोण विकसित किया - जिसमें जाम, जैव-संगत हाइड्रोजेल कण शामिल थे जो तरल जीवाणु संस्कृति में सूजन हो गए थे - 3 डी में कोशिकाओं को सीमित करने के लिए "झरझरा पेट्री डिश" के रूप में। ये मैट्रिक्स नरम, आत्म-उपचार, उपज-तनाव ठोस हैं; इस प्रकार, अन्य बायोप्रिंटिंग प्रक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले क्रॉस-लिंक्ड जैल के विपरीत, एक इंजेक्शन माइक्रोनोजल स्थानीय रूप से हाइड्रोजेल कणों29 को पुनर्व्यवस्थित करके किसी भी निर्धारित 3 डी पथ के साथ मैट्रिक्स के अंदर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकता है। ये कण तब इंजेक्शन बैक्टीरिया के चारों ओर तेजी से और आत्म-उपचार को फिर से घनीभूत करते हैं, बिना किसी अतिरिक्त हानिकारक प्रसंस्करण के कोशिकाओं का समर्थन करते हैं। इसलिए, यह प्रक्रिया 3 डी प्रिंटिंग का एक रूप है जो बैक्टीरिया कोशिकाओं को व्यवस्थित करने में सक्षम बनाता है - एक वांछित 3 डी संरचना में, एक परिभाषित सामुदायिक संरचना के साथ - एक छिद्रपूर्ण मैट्रिक्स के भीतर जिसमें ट्यून करने योग्य भौतिक रासायनिक गुण होते हैं। इसके अलावा, हाइड्रोजेल मैट्रिसेस पूरी तरह से पारदर्शी हैं, जिससे इमेजिंग का उपयोग करके कोशिकाओं को सीधे कल्पना की जा सकती है।

इस दृष्टिकोण की उपयोगिता पहले दो तरीकों से प्रदर्शित की गई है। अध्ययन के एक सेट में, पतला कोशिकाओं को हाइड्रोजेल मैट्रिक्स, जो व्यक्तिगत बैक्टीरिया30,31 की गतिशीलता के अध्ययन सक्षम भर में फैलाया गया. अध्ययन का एक और सेट में, बहुकोशिकीय समुदायों सेंटीमीटर पैमाने पर जैल में 3 डी मुद्रित एक प्रोग्राम माइक्रोस्कोप चरण, जो उनके परिवेश32,33 के माध्यम से बैक्टीरियल सामूहिकता के प्रसार के अध्ययन सक्षम पर घुड़सवार एक इंजेक्शन नोजल का उपयोग कर मुद्रित थे. दोनों ही मामलों में, इन अध्ययनों से तरल संस्कृति / सपाट सतहों पर उन लोगों की तुलना में झरझरा वातावरण में रहने वाले बैक्टीरिया की फैलने वाली विशेषताओं में पहले अज्ञात अंतर का पता चला। हालांकि, यह देखते हुए कि वे एक खुर्दबीन मंच पर घुड़सवार थे, इन पिछले अध्ययन छोटे नमूना मात्रा (~ 1 एमएल) और इसलिए, कम प्रयोगात्मक समय तराजू तक सीमित थे. वे उच्च स्थानिक संकल्प के साथ इनोकुला ज्यामिति को परिभाषित करने की अपनी क्षमता में भी सीमित थे।

यहां, इस प्रयोगात्मक मंच की अगली पीढ़ी जो दोनों सीमाओं को संबोधित करती है, का वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं जिसके द्वारा एक संशोधित 3 डी प्रिंटर का उपयोग किया जा सकता है जिसमें एक संलग्न सिरिंज एक्सट्रूडर के साथ 3 डी प्रिंट और छवि जीवाणु कालोनियों को बड़े पैमाने पर उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रतिनिधि डेटा इंगित करता है कि बायोफिल्म-पूर्व विब्रियो कोलेरा और प्लवक एस्चेरिचिया कोलाई का उपयोग करके बैक्टीरिया की गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए यह दृष्टिकोण कैसे उपयोगी हो सकता है। यह दृष्टिकोण बैक्टीरियल कॉलोनियों को लंबे समय तक बनाए रखने और विभिन्न इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके कल्पना करने में सक्षम बनाता है। इसलिए, 3 डी झरझरा आवासों में जीवाणु समुदायों का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता में जबरदस्त शोध और लागू क्षमता है, जो आंत, त्वचा, फेफड़े और मिट्टी में रोगाणुओं के उपचार और अध्ययन को प्रभावित करती है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग भविष्य में 3 डी प्रिंटिंग बैक्टीरिया-आधारित इंजीनियर जीवित सामग्री के लिए अधिक जटिल फ्रीस्टैंडिंग आकार में किया जा सकता है।

Protocol

यह दृष्टिकोण ताशमान एट अल.34द्वारा पहले से स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक वाणिज्यिक 3 डी फ्यूज्ड डिपोजिशन मॉडलिंग प्रिंटर को 3 डी बायोप्रिंटर में बदलना है। संक्षेप में, ताशमान एट अल ने एक वाणिज्यिक एक्सट्रूडर सिर को कस्टम-निर्मित सिरिंज पंप एक्सट्रूडर के साथ बदल दिया। यह एक्सट्रूडर 3 डी में बैक्टीरिया कोशिकाओं के अत्यधिक केंद्रित तरल निलंबन की छपाई को सक्षम बनाता है, इसकी एक्सट्रूडेड वॉल्यूम और जी-कोड प्रोग्रामिंग भाषा द्वारा नियंत्रित 3 डी स्थिति के साथ। एक्सट्रूडेड वॉल्यूम को एक्सट्रूडर स्टेप (ई-स्टेप) द्वारा सॉफ्टवेयर में निर्दिष्ट किया गया है और इसके अतिरिक्त नीचे वर्णित अनुसार कैलिब्रेट किया गया है। इन बैक्टीरियल सस्पेंशन को सीधे एक दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में मुद्रित किया जाता है, जो कोशिकाओं के लिए 3 डी समर्थन के रूप में कार्य करता है। नीचे, प्रोटोकॉल यह भी वर्णन करता है कि विभिन्न बहुलक सांद्रता के साथ मैट्रिसेस कैसे तैयार करें, ताकना आकार और रियोलॉजिकल गुणों में परिणामी परिवर्तनों की विशेषता बताएं, और प्रत्यक्ष इमेजिंग का उपयोग करके बाद में जीवाणु गतिशीलता और विकास की विशेषता बताएं।

1. एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर का 3 डी बायोप्रिंटर में रूपांतरण

  1. एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर से एक्सट्रूडर और हीटर निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. एक डिस्पोजेबल ल्यूर लॉक सिरिंज को समायोजित करने के लिए एक अतिरिक्त संशोधन के साथ, सिरिंज पंप एक्सट्रूडर34 बनाने के लिए पिछले प्रोटोकॉल का पालन करें। प्रिंटर पर सिरिंज पंप एक्सट्रूडर माउंट करें।
    नोट: प्लास्टिक सीरिंज के लिए सिरिंज पंप बाहर निकालना संशोधित करने के लिए आवश्यक सीएडी फाइलें पूरक फाइलों 1-3 में प्रदान की जाती हैं.
  3. कंप्यूटर पर 3D प्रिंटर सॉफ़्टवेयर स्थापित करें और खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 3D प्रिंटर को कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
  4. तंत्र के ऊपर और नीचे के हिस्सों को संरेखित करके 3 डी-मुद्रित क्लैंप में उचित आकार की सुई के साथ 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज लोड करें (चित्र 1)। तीन एम 8 सॉकेट बोल्ट और पतले स्टील हेक्स नट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके सिरिंज के चारों ओर क्लैंप को सुरक्षित करें। सिरिंज सवार सिरिंज पंप extruder में नेतृत्व पेंच के साथ जोड़ता है. मैन्युअल रूप से सिरिंज में हवा के अंतर का एक 0.5 एमएल बनाने के लिए नेतृत्व पेंच घूर्णन द्वारा सवार उठा.
  5. यदि संदूषण प्रयोग के लिए एक चिंता का विषय है, तो सिरिंज-क्लैंप कॉम्प्लेक्स को बायोहुड में ले जाएं और निम्न चरणों को पूरा करने से पहले प्रवेश पर 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ जीवाणुरहित करें।

2. बैक्टीरियल निलंबन की तैयारी

  1. कोलाई के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2% लेनोक्स एलबी (लुरिया शोरबा, सामग्री की तालिका) अगर प्लेट पर रातोंरात बढ़ते हैं।
    1. वी कोलेरा के लिए, दस बाँझ कांच मोती के साथ तरल एलबी के 3 एमएल में कोशिकाओं को टीका लगाना. ~ 0.9 के एक ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) 600 के लिए मध्य घातीय चरण तक 5-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को विकसित करें।
    2. ई कोलाई के लिए, कोशिकाओं को तरल एलबी के 3 एमएल में टीका लगाएं। कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में विकसित करें। 3 घंटे के लिए ताजा एलबी में रातोंरात संस्कृति के 200 माइक्रोन को निर्दोष करें जब तक कि आयुध डिपो 0.6 तक नहीं पहुंच जाता।
  2. संस्कृति को 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक गोली बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 5,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए संस्कृति अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें. एमएल प्रति ~ 9 x 1010 कोशिकाओं की सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए तरल एलबी के ~ 10 माइक्रोन के साथ पुन: निलंबित करें।

3. सिरिंज में बैक्टीरिया निलंबन लोड हो रहा है

नोट: सिरिंज में बैक्टीरिया लोड करने के लिए दो तरीके प्रदान किए जाते हैं (चरण 3.1 और चरण 3.2)। चरण 3.1 बैक्टीरियल निलंबन की छोटी मात्रा, <200 माइक्रोन लोड करने के लिए काम करता है, और चरण 3.2 बैक्टीरिया निलंबन की बड़ी मात्रा लोड करने के लिए काम करता है, >200 माइक्रोन।

  1. 3 डी bioprinter में एक खाली 1 एमएल प्लास्टिक Luer ताला सिरिंज लोड. लीड स्क्रू के साथ सिरिंज प्लंजर कनेक्ट करें। मैन्युअल रूप से हवा के अंतर के 0.2 एमएल जोड़ने के लिए सिरिंज वापस लेने के लिए सवार के लिए जगह प्रदान करने के लिए कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा ~ 20-50 माइक्रोन प्रयोगों के प्रत्येक बैच के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में.
    1. आवश्यक प्रिंट सुविधाओं के आकार के लिए आवश्यक सुई आकार के साथ सिरिंज टिप के लिए एक कुंद सुई संलग्न करें। यहां, 2 इंच की 20 G सुई का उपयोग किया जाता है।
    2. सुई के नीचे बैक्टीरियल इनोकुलम के साथ 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब रखकर सिरिंज में बैक्टीरिया निलंबन लोड करें। मैन्युअल रूप से सिरिंज सवार वापस लेने और सिरिंज में कोशिकाओं को लोड करने के लिए पेंच बारी बारी से. जीवाणु कोशिका की मात्रा इतनी छोटी होती है कि अक्सर, कोशिकाओं को केवल सुई में लोड किया जाता है।
  2. सिरिंज-क्लैंप कॉम्प्लेक्स से सवार निकालें और एक और सिरिंज और सुई का उपयोग करने के लिए ध्यान से वांछित जीवाणु निलंबन के साथ सिरिंज-क्लैंप कॉम्प्लेक्स लोड करने के लिए, हवा के बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए सावधान रहें। सिरिंज-क्लैंप कॉम्प्लेक्स को वांछित बैक्टीरियल निलंबन के साथ ब्रिम से थोड़ा अधिक भरा जाना चाहिए और फिर बायोप्रिंटर में स्थानांतरित किया जाना चाहिए।
    1. ध्यान से जैव प्रिंटर बाहर निकालना के मुख्य कोर पर इसी सॉकेट में सवार के बिना सिरिंज-दबाना परिसर डालें.
    2. सुनिश्चित करें कि प्रिंटर गाड़ी लीड स्क्रू से लगभग आधा ऊपर है, और लोड की गई सिरिंज के नीचे एक संग्रह डिश मौजूद है। फिर, ध्यान से गाड़ी और सिरिंज-क्लैंप कॉम्प्लेक्स दोनों के माध्यम से सवार डालें जब तक कि यह गाड़ी पर पकड़ न ले। सिरिंज में हवा के बुलबुले फँसाने से बचने के लिए बैक्टीरिया निलंबन में धीरे धीरे सवार दबाना.
    3. एडेप्टर क्लैंप को प्लंजर के पीछे गाड़ी पर स्लाइड करें ताकि इसे एक्सट्रूज़न और रिट्रैक्शन युद्धाभ्यास दोनों के लिए सुरक्षित किया जा सके।

4. जमा मात्रा के लिए एक्सट्रूडर चरण का अंशांकन

  1. जमा मात्रा के लिए एक्सट्रूडर कदम (ई-चरण) जांचना करने के लिए, पहले सटीक सिरिंज, सिरिंज सुई, और प्रयोग में इस्तेमाल किया जाएगा कि जीवाणु निलंबन जमा के साथ जैव प्रिंटर की स्थापना. यहां, 1 एमएल लुअर लॉक सिरिंज का उपयोग किया जाता है।
  2. एक मनमाना ई-चरण संख्या (~ 200) extruding द्वारा पर जांच करने के लिए एक अनुमानित ई कदम रेंज निर्धारित करें और सिरिंज मात्रा मार्करों के साथ सवार मात्रा परिवर्तन नोट.
  3. अंशांकन स्वीप ओवर प्रदर्शन करने के लिए ई-चरण सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए वॉल्यूम अनुपात के लिए इस मोटे ई-चरण का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, यदि 200 का ई-स्टेप दृश्य निरीक्षण द्वारा लगभग 20 माइक्रोन को बाहर निकालता है और कोई 10-200 माइक्रोन जमा करना चाहता है, तो 100-2000 के बीच ई-चरणों का परीक्षण करें।
  4. रैखिक अंशांकन स्वीप करने के लिए, पहले लेबल और 0.1 मिलीग्राम संवेदनशीलता के साथ एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर बीस 1.5 एमएल नमूना ट्यूबों के शुष्क द्रव्यमान को मापें।
  5. पूर्व मापा 1.5 एमएल ट्यूबों में बैक्टीरियल निलंबन extrude. प्रत्येक ई-चरण के लिए, कम से कम 2 प्रतिकृतियां करें। रैखिक सीमा पर सभी ई-चरणों के लिए दोहराएं, आवश्यकतानुसार बैक्टीरिया निलंबन की जगह। यदि संदूषण प्रयोग के लिए एक चिंता का विषय है, तो प्रत्येक नमूने के बाद 70% इथेनॉल के साथ संतृप्त एक लिंट-फ्री वाइप के साथ सिरिंज सुई के बाहरी हिस्से को पोंछ लें।
  6. एक ही विश्लेषणात्मक संतुलन के साथ सभी 1.5 एमएल ट्यूबों के द्रव्यमान को मापें। जमा किए गए बैक्टीरियल निलंबन का शुद्ध द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए दूसरे से पहला द्रव्यमान मूल्य घटाएं।
  7. बैक्टीरियल निलंबन के द्रव्यमान को सामग्री घनत्व के साथ एक मात्रा में परिवर्तित करें। मुख्य रूप से पानी से बने कई जीवाणु निलंबन के लिए, 1 ग्राम /
  8. अंशांकन प्रक्रिया को समाप्त करने के लिए ई-चरण और एक्सट्रूडेड वॉल्यूम के बीच एक रैखिक फिट करें।

5. दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स की तैयारी

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, मैट्रिक्स बाँझ रखने के लिए 2% लेनोक्स लुरिया-बर्टानी (एलबी) के 400 एमएल में क्रॉस-लिंक्ड ऐक्रेलिक एसिड / एल्काइल एक्रिलेट कॉपोलिमर ( सामग्री की तालिकादेखें) के सूखे दानों को जोड़ें; हालांकि, हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को प्रफुल्लित करने के लिए अन्य तरल सेल संस्कृति मीडिया का भी उपयोग किया जा सकता है।
    नोट: एलबी में जोड़े गए दानों का वजन प्रतिशत उस छिद्र आकार पर निर्भर करता है जिसका लक्ष्य है। वर्तमान अध्ययन में, 0.9% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के लिए, 3.6 ग्राम सूखे दानों को एलबी में जोड़ा जाता है और 1.2% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के लिए, 4.8 ग्राम सूखे दानों को एलबी में जोड़ा जाता है। हाइड्रोजेल कणिकाओं को 2 मिनट के लिए स्टैंड मिक्सर में मिलाकर समरूप रूप से फैलाया जाता है।
  2. एक बार मिश्रित, सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए 10 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) के 20 से 500 माइक्रोन वेतन वृद्धि जोड़कर पीएच को 7.4 तक समायोजित करें। NaOH के प्रत्येक जोड़ के बाद, मिश्रण में एक विंदुक टिप डुबकी और फिर एक पीएच परीक्षण कागज पर हाइड्रोजेल मैट्रिक्स पोंछते द्वारा पीएच को मापें.
    नोट: जैसे ही NaOH जोड़ा जाता है, मिश्रण की चिपचिपाहट बढ़ जाएगी क्योंकि हाइड्रोजेल के दाने सूजने लगते हैं। सूजे हुए हाइड्रोजेल ग्रैन्यूल ~ 5 माइक्रोन से 10 माइक्रोन व्यास के होते हैं और हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में एक साथ जाम हो जाते हैं। कणिकाओं का आंतरिक जाल आकार ~ 40 एनएम से 100 एनएम है, जैसा कि पहले32 स्थापित किया गया था। जाल का आकार छोटे अणुओं (जैसे, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों) के लिए स्वतंत्र रूप से फैलाने के लिए काफी बड़ा होता है, लेकिन बैक्टीरिया के लिए अंतरालीय छिद्रों के बीच सीमित होने के लिए काफी छोटा होता है।
  3. अगला, दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को 50 एमएल बाँझ प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग करके 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। मिश्रण प्रक्रिया के दौरान गठित बुलबुले को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 161 x ग्राम पर हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को अपकेंद्रित्र करें।
  4. हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को कमरे के तापमान पर कम से कम 2 दिनों तक बैठने की अनुमति दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई संदूषण नहीं हुआ है। संदूषण हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में निलंबित माइक्रोकॉलोनियों के रूप में प्रकट होता है। दो दिनों के बाद, हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को 1 मिन के लिए 161 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें ताकि किसी भी अतिरिक्त बुलबुले को हटाया जा सके।
    नोट: प्रोटोकॉल को एक सप्ताह तक कमरे के तापमान पर हाइड्रोगेल मैट्रिक्स को स्टोर करके यहां रोका जा सकता है।
  5. जैव सुरक्षा कैबिनेट में, 30 एमएल बाँझ प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग करके, हाइड्रोगेल मैट्रिक्स की वांछित मात्रा को कंटेनर में स्थानांतरित करें जहां मुद्रण होगा (यहां 20 एमएल टिशू कल्चर फ्लास्क के लिए ~ 20 एमएल या 1 एमएल प्लास्टिक माइक्रो क्यूवेट के लिए 1 एमएल का उपयोग किया गया था)।

6. दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स रियोलॉजिकल गुणों की विशेषता

  1. हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के ~ 3 एमएल को एक कतरनी रियोमीटर में लोड करें ( सामग्री की तालिकादेखें) रियोलॉजिकल गुणों को मापने के लिए खुरदरा 50 मिमी व्यास समानांतर प्लेटों के बीच 1 मिमी अंतर के साथ।
  2. 10-4 एस-1 से 102 एस-1 (जैसे, चित्रा 2ए) से कतरनी दर के लघुगणकीय स्वीप के एक समारोह के रूप में कतरनी तनाव को मापकर कतरनी रियोमीटर पर यूनिडायरेक्शनल कतरनी माप का उपयोग करके उपज व्यवहार की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: कम कतरनी दरों पर, हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में एक निरंतर कतरनी तनाव (उपज तनाव) होगा जो कतरनी दर से स्वतंत्र है। उच्च कतरनी दरों पर, कतरनी दर पर शक्ति-कानून निर्भरता के साथ कतरनी तनाव बढ़ जाएगा, जो हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के द्रवीकरण का संकेत देता है। यह उपज-तनाव व्यवहार बैक्टीरिया को दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स29 के भीतर 3 डी मुद्रित करने की अनुमति देता है।
  3. भंडारण और हानि मॉड्यूली, जी ' और जी' क्रमशः, 1% के तनाव आयाम और 0.1 से 1 हर्ट्ज (जैसे, चित्रा 2 बी) के बीच आवृत्तियों के साथ छोटे आयाम दोलन रियोलॉजी का उपयोग करके आवृत्ति के एक समारोह के रूप में मापें।
    नोट: 3 डी प्रिंटिंग के लिए आदर्श दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में नुकसान मापांक से बड़ा भंडारण मापांक होना चाहिए, जो इंगित करता है कि माध्यम एक जाम लोचदार ठोस29 के रूप में कार्य करता है।

7. दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स अंतरालीय ताकना आकार की विशेषता

  1. सोनिकेट 100 एनएम कार्बोक्सिलेटेड फ्लोरोसेंट पॉलीस्टायर्न नैनोकणों (~ 3.6 x 1013 कण/एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) 15 मिनट के लिए उनकी पैकेजिंग में कणों के किसी भी एकत्रीकरण/समूहों को तोड़ने के लिए फिर से निलंबित करने के लिए। नैनोकणों के 50 माइक्रोन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    1. कमरे के तापमान पर 9,500 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जब तक गोली रूपों और सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है. सतह पर तैरनेवाला निकालें और दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स तैयार करने के लिए इस्तेमाल तरल विकास मीडिया (यहां एलबी) के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: प्रोटोकॉल को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पुन: निलंबित नैनोकणों को संग्रहीत करके यहां रोका जा सकता है।
  2. 30 मिनट के लिए resuspended नैनोकणों Sonicate. दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के 1 एमएल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में पुन: निलंबित नैनोकणों के 1 माइक्रोन जोड़ें और उन्हें एक विंदुक टिप के साथ मिलाएं। मिश्रण के बाद, कमरे के तापमान पर 161 x ग्राम पर 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र।
  3. हाइड्रोजेल मैट्रिक्स और नैनोपार्टिकल मिश्रण को 35 मिमी व्यास पेट्री डिश में 0.1 मिमी मोटी ग्लास तल के साथ अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। कुआं व्यास में 20 मिमी और गहराई में 1 मिमी है। शीर्ष पर एक ग्लास coverslip रखें और इमेजिंग के दौरान प्रवाह और वाष्पीकरण को अक्षम करने के लिए नीचे दबाएँ. ग्लास कवरस्लिप का एक विकल्प शीर्ष पर 1 एमएल पैराफिन तेल जोड़ना है।
  4. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में 8x अतिरिक्त ज़ूम के साथ 40x तेल उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नैनोकणों की छवि ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: सॉफ्टवेयर में अतिरिक्त डिजिटल ज़ूम का उपयोग करने के बजाय एक उच्च आवर्धन उद्देश्य का उपयोग किया जा सकता है।
    1. देखने के क्षेत्र में कम से कम चार नैनोकणों के साथ 2 मिनट के लिए एक एकल जेड-प्लेन में कोई देरी (आदर्श ~ 19 फ्रेम/एस) के साथ एक समय पाश छवि। आंकड़ों (100 से 200 नैनोकणों) के लिए पर्याप्त डेटा एकत्र करने के लिए विभिन्न स्थानों में 15 से 20 बार दोहराएं।
  5. कणों के विस्थापन का विश्लेषण करने के लिए एक कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। यहां, नैनोपार्टिकल35 के द्रव्यमान के केंद्र को ट्रैक करने के लिए क्लासिक क्रोकर-ग्रियर एल्गोरिथ्म के आधार पर एक कस्टम-लिखित स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाता है ( पूरक फ़ाइल 7 देखें)।
    1. कण ट्रैकिंग से, माध्य वर्ग विस्थापन (एमएसडी) की गणना करें। एमएसडी कम लंबाई और समय के पैमाने पर छिद्र स्थान में मुक्त प्रसार का प्रदर्शन करेगा और कारावास35 के कारण बड़ी लंबाई और समय के पैमाने पर उप-विसारक स्केलिंग में संक्रमण करेगा।
  6. लंबाई के पैमाने की पहचान करें जहां स्थानीय छिद्र आकार का अनुमान लगाने के लिए उप-विसारक स्केलिंग में संक्रमण होता है। नैनोपार्टिकल व्यास के लिए इस लंबाई पैमाने को जोड़कर ताकना आकार की गणना करें। मापा हर नैनोकण के लिए ताकना आकार विश्लेषण दोहराएँ. यह एक ताकना आकार वितरण जिसमें से एक मतलब ताकना आकार (जैसे, चित्रा 3) की गणना की जा सकती है उपज जाएगा.

8. 3D मुद्रण प्रक्रिया

  1. नमूना कंटेनरों के लिए 3 डी-प्रिंट कस्टम-मेड धारक (सीएडी फाइलों के लिए पूरक फाइलें 4-6 देखें)। यहां, टिशू कल्चर फ्लास्क और माइक्रोक्यूवेट्स के लिए धारकों का उपयोग किया जाता है। धारक प्रिंटर को एक प्रिंट सत्र में कई नमूने प्रिंट करने के लिए प्रोग्रामिंग करने की अनुमति देते हैं। बिल्ड प्लेटफॉर्म पर धारकों में हाइड्रोजेल मीडिया के साथ नमूना कंटेनर रखें।
  2. 3 डी प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर खोलें। सॉफ्टवेयर में एक पूर्व-क्रमादेशित जी-कोड लोड करें। प्रतिनिधि परिणामों के लिए, चरण 3.1 का उपयोग बैक्टीरिया निलंबन को 3 डी प्रिंटर में लोड करने के लिए किया जाता है।
    नोट: रैखिक ऊर्ध्वाधर ज्यामिति मुद्रण के लिए एक जी कोड का एक उदाहरण तालिका 1 में दिया गया है.
  3. 3 डी प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से, एक्स-वाई-जेड विमानों को एक्स-वाई विमान पर प्रिंट हेड को केंद्र में लाने के लिए पहले कंटेनर और फिर जेड-अक्ष घर पर ले जाएं। होमिंग z-अक्ष प्रिंट हेड को ऊपर उठाएगा। मैन्युअल रूप से धीरे धीरे पेंच बारी बारी से सिरिंज सवार दबाना जब तक बैक्टीरियल निलंबन की एक छोटी राशि सुई की नोक पर देखा जा सकता है.
    1. हल्के से एक बाँझ डिस्पोजेबल पोंछे के साथ अतिरिक्त जीवाणु निलंबन को मिटा दें। नमूना धारक, सुई और सिरिंज की ऊंचाई के आधार पर, 3 डी प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, पसंद के नमूना कंटेनर में हाइड्रोगेल मीडिया में प्रिंट हेड को एक निश्चित दूरी कम करें। प्रिंट पर क्लिक करके प्रिंटिंग प्रक्रिया शुरू करें।
  4. एक बार मुद्रण पूरा हो गया है, नमूना कंटेनर बंद करें। 70% इथेनॉल के साथ प्रिंटर को पोंछ लें। सिरिंज और सुई का ठीक से निपटान।

9. बढ़ते और इमेजिंग वी. हैजा

  1. बड़े फील्ड-ऑफ़-व्यू इमेजिंग के लिए, लाइटबॉक्स के साथ छवि सेल विकास के लिए ज़ूम लेंस अटैचमेंट वाले कैमरे का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर मुद्रण के ठीक बाद नमूनों की छवि बनाएं और फिर उन्हें इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। प्रयोग के दौरान इमेजिंग सत्रों के बीच एक स्थिर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने बनाए रखें।
  2. दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में लंबी अवधि में विकास व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए वांछित समय पर छवियों को कैप्चर करें।

Representative Results

दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के साथ एक 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग बैक्टीरिया कालोनियों को आकार में मुद्रित करने के लिए बायोप्रिंटर की क्षमताओं का विस्तार करता है, जो कि जब इसके बजाय एक फ्लैट सब्सट्रेट पर मुद्रित होता है, तो बैक्टीरिया निलंबन की कम चिपचिपाहट के कारण गिरावट आएगी। यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण का संकल्प बाहर निकालना गति, सुई के आकार, प्रिंट सिर की गति, सुई में हवा, और बैक्टीरियल निलंबन की चिपचिपाहट पर निर्भर करता है. बैक्टीरियल निलंबन की कम मात्रा के कारण, सिरिंज और सुई में बैक्टीरिया के निलंबन के लोडिंग के दौरान हवा के बुलबुले अनजाने में पेश किए जा सकते हैं। यह एक हवा बुलबुला अंतिम मुद्रित संरचना (चित्रा 4) में जमा किया जा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. प्रिंट में पेश किए जाने वाले हवाई बुलबुले के लिए एक और तरीका यह है कि यदि कोई मुद्रण से पहले सुई की नोक पर बैक्टीरिया निलंबन की एक छोटी बूंद बनाने के लिए सवार को दबाता नहीं है और सुई की नोक पर एक हवा का अंतर मौजूद है। मुद्रण से पहले सिरिंज सवार को निराश नहीं करना भी एक ही बैच में मुद्रित होने वाली कोशिकाओं के विभिन्न संस्करणों को जन्म दे सकता है। हालांकि, जैसे-जैसे समय आगे बढ़ता है, हवा का बुलबुला आसपास के माध्यम में घुल जाता है, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है।

एक्सट्रूज़न चरण को कैलिब्रेट करने के लिए, जमा मात्रा इस बात पर निर्भर करती है कि प्रिंट हेड का रैखिक एक्ट्यूएटर सिरिंज प्लंजर का अनुवाद कैसे करता है, सिरिंज का आंतरिक व्यास सीधे वॉल्यूम को प्रभावित करेगा। इसके अलावा, बैक्टीरियल निलंबन के रियोलॉजिकल गुण इस बात को प्रभावित करेंगे कि वे सुई के संकुचन के माध्यम से आसानी से प्रिंट करने के लिए कितनी आसानी से कतरनी करते हैं। इस प्रकार, इस अंशांकन प्रक्रिया हर सिरिंज/सुई/बैक्टीरियल निलंबन सेटअप के लिए फिर से किया जाना चाहिए. सिद्धांत रूप में, सिरिंज अंशांकन स्वचालित किया जा सकता है। हालांकि, व्यवहार में, ऐसा कोड लिखना जो मोटे तौर पर कई उपयोग मामलों पर लागू होता है, चुनौतीपूर्ण होगा। उदाहरण के लिए, एक उपयोगकर्ता एक 1 एमएल सिरिंज से लगभग 300 माइक्रोन के बाहर निकालना जांचना करने के लिए एक उपयोगकर्ता 30 माइक्रोन के एक लक्ष्य मात्रा के आसपास calibrating एक उपयोगकर्ता की तुलना में बहुत अधिक बार सिरिंज फिर से लोड करने की आवश्यकता होगी. चूंकि अंशांकन प्रक्रिया शुरू होने पर वॉल्यूम अंशांकन स्थिरांक के लिए ई-चरण अज्ञात है, इसलिए उपयोगकर्ता यह अनुमान लगाने में सक्षम नहीं हो सकता है कि वास्तव में कितनी बार पुन: लोडिंग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अंशांकन प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए, प्रत्येक पूर्व वजन 1.5 एमएल ट्यूब की सटीक स्थिति निर्दिष्ट करने की आवश्यकता होगी. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी बायोइंक सुई से ट्यूब में सटीक अंशांकन के लिए जमा किए जाते हैं, सुई और ट्यूब के नीचे/दीवार के बीच सटीक संपर्क किया जाना चाहिए। अच्छे संपर्क के बिना, छोटी बूंदें गीली रह सकती हैं और सुई से जुड़ी हो सकती हैं। इस प्रकार, ट्यूबों के बीच किसी भी स्थितीय भिन्नता अंशांकन प्रक्रिया में त्रुटियों के लिए बहुत योगदान हो सकता है. इन कारणों से, लेखक अनुशंसा करते हैं कि प्रत्येक उपयोगकर्ता एक अंशांकन कार्यक्रम बनाता है जो उनकी अनूठी आवश्यकताओं के अनुरूप हो।

यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की एक प्रमुख विशेषता इमेजिंग का उपयोग करके गतिशीलता और विकास के माध्यम से सीधे अपने वातावरण के माध्यम से फैलने वाले बैक्टीरिया की कल्पना करने की क्षमता है। इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल के एक पुराने संस्करण में, 6 अच्छी तरह से प्लेटें एक दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के 19 एमएल के साथ भर रहे थे. हालांकि, यहां तक कि एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर मनाया जा सकता है कि कोशिकाओं की एक क्षैतिज रेखा के एक सफल 3 डी प्रिंट के साथ, एक घने कॉलोनी भी ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5) के साथ दृश्य सीमित माध्यम की ऊपरी सतह पर बढ़ेगा. शीर्ष सतह पर कॉलोनी की संभावना संदूषण के परिणामस्वरूप हुई क्योंकि सिरिंज सुई को मुद्रण के दौरान माध्यम से रखा या हटा दिया गया था। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, कोशिकाओं की ऊर्ध्वाधर लाइनों जगमगाहट शीशियों(चित्रा 6ए)में मुद्रित कर रहे हैं. हालांकि, बेलनाकार शीशियों की वक्रता इमेजिंग के दौरान विरूपण का कारण बनी। इससे मुद्रण के लिए नमूना कंटेनरों के रूप में फ्लैट-दीवार वाले क्यूवेट और टिशू कल्चर फ्लास्क का चयन हुआ, जिससे अनियंत्रित इमेजिंग(चित्रा 6बी-डी)की अनुमति मिली। टिशू कल्चर फ्लास्क की एक सीमा छोटी झुकी हुई गर्दन है जो ज्यामिति को सीमित करती है जिसे मुद्रित किया जा सकता है।

एक साथ लिया गया, यह प्रोटोकॉल लंबे समय तक तराजू पर जटिल झरझरा वातावरण में जीवाणु गतिशीलता और विकास के अवलोकन के लिए अनुमति देता है। कुछ उदाहरणों को बायोफिल्म बनाने के लिए चित्रा 6 बी में दिखाया गया है, वी हैजा, ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, साथ ही लेजर-स्कैनिंग प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ई कोलाई की प्लैंकटोनिक कोशिकाएं-इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करती हैं। दरअसल, हाइड्रोजेल मैट्रिसेस का एक संभावित मुद्दा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेज किए जाने पर उनका संभावित ऑटोफ्लोरेसेंस है; हालांकि, चित्रा 6 एफ, जी में दिखाए गए चित्र प्रदर्शित करते हैं कि यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक मंच में इस तरह के ऑटोफ्लोरेसेंस न्यूनतम है। इस तरह के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण की एक और सीमा उनके स्थानिक संकल्प है, जो ~ 100 एस नैनोमीटर पर विवर्तन सीमा द्वारा निर्धारित किया जाता है; हालांकि, यह लंबाई पैमाने एक व्यक्तिगत जीवाणु कोशिका के आकार से बहुत छोटा है, और इसलिए, ऑप्टिकल तकनीक व्यक्तिगत कोशिकाओं (चित्रा 6जी) के पैमाने से बड़े, बहुकोशिकीय कालोनियों30,31,32,33के पैमाने तक बैक्टीरिया कोशिकाओं की छवि बनाने की क्षमता प्रदान करती है। अतिरिक्त उदाहरण नीचे वर्णित हैं।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण का उपयोग छोटे (1 एमएल) और बड़े (20 एमएल) मैट्रिक्स वॉल्यूम में 3 डी-प्रिंट और छवि बैक्टीरियल कॉलोनियों के लिए किया जा सकता है। इसलिए, विभिन्न संस्करणों का उपयोग करके प्राप्त परिणामों में अंतर नीचे वर्णित किया गया है, प्रतिनिधि उदाहरणों के रूप में मोटाइल और गैर-मोटाइल वी हैजा की 3 डी-मुद्रित कॉलोनियों का उपयोग करते हुए। प्रिंट का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन (लाइन की चौड़ाई) नोजल के आंतरिक व्यास द्वारा निर्धारित किया जाता है। नीचे वर्णित उदाहरणों में, 0.6 मिमी के आंतरिक व्यास वाली सुई के परिणामस्वरूप 0.6 मिमी की प्रारंभिक बेलनाकार कॉलोनी होती है। पिछले काम से पता चला है कि प्रिंट संकल्प ~ 100-200 माइक्रोन33 के एक आंतरिक व्यास के साथ एक खींचा गिलास केशिका का उपयोग करके आगे भी कम किया जा सकता है.

छोटी मात्रा के लिए, दो अलग-अलग छिद्र आकार वितरण के साथ दो अलग-अलग दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस का उपयोग किया जाता है: एक औसत ताकना आकार के साथ एक वी कोलेरा सेल के औसत व्यास से बड़ा होता है, 0.2-0.4 माइक्रोन36, और दूसरा इस व्यास से छोटा औसत ताकना आकार के साथ। बारह दिनों में नमूने छवि और समय के साथ कालोनियों के क्षेत्रीय विस्तार की छवि विश्लेषण के माध्यम से मापा जाता है (चित्रा 7 और चित्रा 8)। गैर-प्रेरक कोशिकाओं के लिए, जो केवल सेलुलर विकास के माध्यम से अपने परिवेश के माध्यम से फैल सकते हैं, क्षेत्र विस्तार की दर जांच की गई विभिन्न मैट्रिक्स (चित्रा 7) के बीच समान थी, यह दर्शाता है कि मैट्रिक्स छिद्र आकार में अंतर विकास के माध्यम से सेलुलर प्रसार को प्रभावित नहीं करते हैं - जैसा कि अपेक्षित था। इसके विपरीत, सक्रिय गतिशीलता के माध्यम से अपने परिवेश के माध्यम से फैलने वाली मोटाइल कोशिकाओं के लिए, बड़े छिद्रों के साथ हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के लिए वी. कोलेरा के क्षेत्रीय विस्तार की दर अधिक थी-जिसके लिए हाइड्रोजेल अनाज द्वारा कारावास सेलुलर गतिशीलता को कम करता है। बैक्टीरियल प्रसार में ये अंतर कॉलोनी आकृति विज्ञान(चित्रा 8)में भी स्पष्ट थे। बड़े छिद्रों के साथ हाइड्रोजेल मैट्रिसेस में वी कोलेरा की कॉलोनी चिकनी, फैलाना प्लम (चित्रा 8 ए) के माध्यम से फैलती है, जो सक्रिय गतिशीलता के माध्यम से फैलने को दर्शाती है जैसा कि पहले32 देखा गया था। दरअसल, इस व्याख्या के अनुरूप, इन फैलाना plumes गैर motile कोशिकाओं (चित्रा 8C) के मामले में नहीं मनाया जाता है. इसके अतिरिक्त, छिद्र पर्याप्त रूप से बड़े होते हैं कि कोशिकाएं मोतियों को धक्का नहीं देती हैं क्योंकि वे छिद्रों के माध्यम से तैरते हैं। इसके अलावा, तैराकी द्वारा लागू चिपचिपा तनाव 1 पा से कम है, जो आसपास के हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को सराहनीय रूप से विकृत करने के लिए अपर्याप्त है। इसके विपरीत, छोटे छिद्रों के साथ हाइड्रोजेल मैट्रिसेस में कॉलोनी केवल मोटाइल और गैर-प्रेरक कोशिकाओं (चित्रा 8 बी, डी) दोनों के लिए किसी न किसी, भग्न जैसे प्लम के माध्यम से फैलती है, जो सेलुलर विकास के माध्यम से पूरी तरह से फैलने को दर्शाती है, जबकि कोशिकाएं बढ़ती हैं वे क्षणिक रूप से विकृत हो जाते हैं और आसपास के मैट्रिक्स का उत्पादन करते हैं। वास्तव में, यह देखते हुए कि हाइड्रोजेल मैट्रिसेस की उपज तनाव कोशिकाओं के टगर दबाव की तुलना में बहुत छोटा है, छोटे छिद्र आकार की इस सीमा में, मैट्रिक्स केवल सेलुलर विकास के लिए कमजोर प्रतिरोध प्रदान करता है और 3 डी मुद्रित संरचना को दृढ़ता से प्रभावित नहीं करता है, जैसा कि हमारे पिछले काम37 में सत्यापित है।

इसी तरह के परिणाम बड़ी मात्रा में नमूनों में किए गए प्रयोगों के लिए देखे जाते हैं; हालांकि, इन नमूनों में पोषक तत्वों की अधिक से अधिक प्रचुरता को देखते हुए, प्रयोग लंबे समय तक तराजू पर सेलुलर विकास को बनाए रख सकते हैं। एक उदाहरण के रूप में, दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस का उपयोग करने वाले परिणाम जहां औसत छिद्र आकार सेल आकार से कम था - और इस प्रकार, सेलुलर प्रसार मुख्य रूप से विकास के कारण था। नमूनों को दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में ~ 30 दिनों के लिए चित्रित किया जाता है और पहले 150 घंटे के लिए गैर-प्रेरक और प्रेरक कोशिकाओं दोनों के लिए समान क्षेत्र विस्तार देखा जाता है; हालांकि, यहां तक कि लंबे समय तक, नमूनों के बीच मजबूत परिवर्तनशीलता देखी जाती है, कुछ नमूनों में प्रसार की तेज दर प्रदर्शित होती है (चित्र 9 और चित्र 10)। दिलचस्प बात यह है कि प्रयोग के बाद हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को फिर से तैयार करने पर - हाइड्रोजेल मैट्रिक्स की बड़ी मात्रा का लाभ - उपज तनाव में कमी, भंडारण मॉड्यूली, और हानि मॉड्यूली मापा जाता है (चित्र 11), यह दर्शाता है कि मैट्रिसेस नरम हो गए। यह परिवर्तन वी कोलेरा के कारण हो सकता है जो एक अणु का उत्पादन करता है जो हाइड्रोजेल मैट्रिक्स गुणों को बदल रहा है और लंबे समय तक सेलुलर प्रसार को बढ़ावा देता है, जो भविष्य के शोध में परीक्षण करना दिलचस्प होगा। इन प्रयोगों में परिणाम है कि किसी न किसी, भग्न की तरह कॉलोनी आकृति विज्ञान के उदाहरण चित्रा 10 में दिखाया गया है.

Figure 1
चित्रा 1: कस्टम-निर्मित 3 डी बायोप्रिंटर की छवियां। (ए) एक डिस्पोजेबल लुअर लॉक सिरिंज और सुई के साथ एक संशोधित सिरिंज पंप एक्सट्रूडर सिर के साथ बायोप्रिंटर। बायोप्रिंटर ~ 46 सेमी चौड़ा है। (बी)जाम हाइड्रोगेल मैट्रिक्स से भरे फ्लास्क में कोशिकाओं की 3 डी प्रिंटिंग की छवि। छवि की चौड़ाई 87 मिमी है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस के रियोलॉजिकल गुणों की विशेषता। (ए) लागू कतरनी दर के एक समारोह के रूप में कतरनी तनाव। (इ) दोलन आवृत्ति के फलन के रूप में भंडारण एवं हानि माओली, क्रमशः ळ तथा ळ। किंवदंती प्रत्येक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोजेल द्रव्यमान अंश को इंगित करती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दो प्रतिनिधि दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिसेस के ताकना आकार माप। ट्रेसर को ट्रैक करके, प्रत्येक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के लिए विशेषता छिद्र आयामों का वितरण निर्धारित किया जाता है। डेटा को 1-सीडीएफ द्वारा दर्शाया जाता है, जहां सीडीएफ संचयी वितरण कार्य है। किंवदंती प्रत्येक मैट्रिक्स को तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोजेल द्रव्यमान अंश को इंगित करती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बैक्टीरिया के 3 डी प्रिंटिंग के दौरान गठित बुलबुले के उदाहरण। (ए) इमेजिंग सेटअप का योजनाबद्ध। (बी) एलबी में सूजे हुए 1.2% हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में प्रिंट (लाल बॉक्स) के तल पर एक बुलबुले के साथ वी हैजा के विकास के स्नैपशॉट। 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने के 59 घंटे के बाद, हवा का बुलबुला पूरी तरह से भंग हो जाता है, और हाइड्रोजेल मैट्रिक्स की लोच के कारण कॉलोनी वापस गिर जाती है। स्केल बार = 2 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: मोटाइल वी हैजा की क्षैतिज रेखा की छवियां एलबी में सूजन 1.2% हाइड्रोगेल मैट्रिक्स से भरी छह-अच्छी प्लेट में मुद्रित होती हैं और बायोफिल्म जो 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 48 घंटे के बाद शीर्ष सतह पर बनती है। (ए) इमेजिंग सेटअप का योजनाबद्ध। (बी) 3 डी प्रिंटिंग के दौरान संदूषण के कारण शीर्ष सतह पर बायोफिल्म गठन अस्पष्टता को कम करता है और क्षैतिज रेखा की स्पष्ट इमेजिंग की अनुमति नहीं देता है। शीर्ष सतह झुर्रियाँ बनाती है, संभवतः अंतर वृद्धि के कारण। स्केल बार = 5 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: इस विधि में उपयोग किए जा सकने वाले विभिन्न नमूना कंटेनरों के उदाहरण। (ए) वी. हैजा 470 घंटे के बाद 1.2% दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के साथ एक गिलास शीशी में मुद्रित। शीशी की वक्रता विकास को मुश्किल बनाती है। स्केल बार = 5 मिमी (बी) वी. हैजा 1.2% दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स से भरे माइक्रो-क्यूवेट में मुद्रित। फ्लैट पक्ष स्पष्ट इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं, हालांकि, छोटी मात्रा कोशिकाओं को विकास सब्सट्रेट से बाहर चलाने से पहले प्रयोगों की लंबाई को सीमित करती है। (सी) छवि वी हैजा 1.2% दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स से भरा एक ऊतक संस्कृति फ्लास्क में मुद्रित करने के लिए एक ज़ूम लेंस के साथ इमेजिंग सेटअप. माइक्रो-क्यूवेट मामले के समान, फ्लैट पक्ष स्पष्ट इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। टिशू कल्चर फ्लास्क को दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स की बड़ी मात्रा से भरा जा सकता है, इसलिए प्रयोगात्मक समय अवधि को लंबा किया जा सकता है। (डी)37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 100 घंटे के बाद 1.2% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के अंदर मुद्रित वी कोलेरा के ज़ूम लेंस से छवि। स्केल बार = 1 मिमी (ई) छवि फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग सेटअप। (एफ) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 10 दिनों के बाद 1.2% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के अंदर फ्लोरोसेंट ई कोलाई के फोकल माइक्रोग्राफ का 3 डी प्रक्षेपण। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (जी) हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के अंदर फ्लोरोसेंट ई कोलाई के एकल सेल संकल्प कन्फोकल माइक्रोग्राफ। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: वी की कालोनियों के एक समारोह के रूप में क्षेत्र विस्तार हैजा दानेदार हाइड्रोगेल समर्थन matrices के 1 एमएल में मुद्रित. प्लॉट पर डेटा चित्रा 8 की छवि विश्लेषण से है। यह देखा गया कि मोटाइल कोशिकाएं (बंद लाल वृत्त और वर्ग) गैर-प्रेरक कोशिकाओं की तुलना में तेज दर से फैलती हैं, जो विकास और गतिशीलता दोनों द्वारा प्रसार को दर्शाती हैं। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में एक बड़े छिद्र आकार (लाल वर्ग) के साथ प्रेरक कोशिकाएं हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में कोशिकाओं की तुलना में 0.3 माइक्रोन छिद्रों (लाल घेरे) के साथ तेज दर से फैलती हैं। गैर-प्रेरक कोशिकाएं दो छिद्र आकारों के बीच क्षेत्र विस्तार दर में कोई अंतर नहीं दिखाती हैं, क्योंकि वे केवल बढ़ रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: वी की कालोनियों हैजा दानेदार हाइड्रोजेल समर्थन matrices के 1 एमएल में मुद्रित. (ए) 0.9% दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में मोटाइल वी हैजा की वृद्धि और गतिशीलता के स्नैपशॉट जहां ताकना आकार औसत सेल व्यास से बड़ा है. तीर एक फैलाना पंख है कि हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के माध्यम से चलती कोशिकाओं के कारण रूपों का संकेत मिलता है. (बी) 1.2% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में मोटाइल वी हैजा की वृद्धि और गतिशीलता के स्नैपशॉट जहां ताकना आकार औसत सेल व्यास से छोटा है। तीर किसी न किसी, भग्न जैसे पंख का संकेत देते हैं जो सेलुलर विकास के कारण बनता है। (सी) 0.9% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में गैर-प्रेरक वी कोलेरा के समय के विकास के स्नैपशॉट जहां ताकना आकार औसत सेल व्यास से बड़ा है। इस मामले में, गतिशीलता को प्रतिबिंबित करने वाले फैलाना प्लम अवलोकन योग्य नहीं हैं। (डी) 1.2% दानेदार हाइड्रोगेल समर्थन मैट्रिक्स में गैर-प्रेरक वी हैजा के विकास के स्नैपशॉट जहां ताकना आकार औसत सेल व्यास से छोटा है। इस मामले में, विकास को प्रतिबिंबित करने वाले खुरदरे, भग्न जैसे प्लम फिर से देखने योग्य हैं। स्केल सलाखों = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: वी हैजा के कालोनियों के समय के एक समारोह के रूप में क्षेत्र विस्तार 1.2% दानेदार हाइड्रोजेल समर्थन matrices के 20 एमएल में मुद्रित. गैर-प्रेरक (खुले वृत्त) और प्रेरक कोशिकाएं (बंद वृत्त) पहले 100 घंटे के लिए समान दरों पर फैलती हैं। 100 घंटे के बाद, क्षेत्र विस्तार दरों में अंतर देखा जाता है, संभवतः लंबे समय में परिवर्तनशीलता के विकास के कारण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: वी हैजा की कालोनियों 1.2% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिसेस के 22 एमएल में मुद्रित 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है। (शीर्ष) मोटाइल वी. हैजा के विकास के स्नैपशॉट। (नीचे) गैर-प्रेरक वी। दोनों ही मामलों में, विकास को प्रतिबिंबित करने वाले खुरदरे, भग्न जैसे प्लम देखने योग्य हैं। स्केल सलाखों = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: प्रयोग से पहले (0 एच) और प्रयोग के बाद (397 एच) 1.2% दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स के रियोलॉजिकल गुणों की विशेषता। (ए) लागू कतरनी दर के एक समारोह के रूप में कतरनी तनाव। (बी) भंडारण और हानि मॉड्यूली, क्रमशः जी 'और जी', लागू दोलन आवृत्ति के एक समारोह के रूप में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Gcode आदेश कार्य
एम82 निरपेक्ष एक्सट्रूज़न मोड
एम302 एस0 कोल्ड एक्सट्रूज़न सक्षम करें
एम 92 ई 14575 प्रति मिमी एक्सट्रूज़न चरण सेट करें
G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 z-अक्ष और एक्सट्रूज़न स्थिति को शून्य पर सेट करें, और x-, y- स्थिति को 35.71 मिमी और y 88 मिमी पर सेट करें जहां जी-कोड शुरू होने पर प्रिंट हेड होता है
एम 221 एस 100 टी 0 प्रवाह दर को 100% पर सेट करता है
एम107 पंखा बंद कर दो
जी 1 एफ 1 एक्स 35.61 वाई 81 ई 0.1 बायोइंक के 20 माइक्रोन को 50 माइक्रोन/मिनट की फ़ीड दर पर मैट्रिक्स में निकालें जहां वर्तमान स्थिति निर्धारित की गई थी
जी0 एफ200 जेड60 200 मिमी/मिनट के वेग पर मैट्रिक्स और नमूना contianer से बाहर सुई खींचो
जी0 एफ500 एक्स65.81 वाई81.0 500 मिमी/मिनट के वेग से अगले नमूना contiainer के लिए सुई ले जाएँ
जी0 एफ100 जेड0 अगले नमूना कंटेनर में उसी जेड-स्थिति में कम सुई जहां मुद्रण 100 मिमी/मिनट के वेग से शुरू हुआ
जी 1 एफ 1 एक्स 65.81 वाई 81.0 ई 0.2 बायोइंक के 20 माइक्रोन को 50 माइक्रोन/मिनट की फ़ीड दर पर मैट्रिक्स में निकालें जहां वर्तमान स्थिति निर्धारित की गई थी
जी0 एफ200 जेड60 200 मिमी/मिनट के वेग पर मैट्रिक्स और नमूना contianer से बाहर सुई खींचो
जी0 F500 X96.01 Y81.0 500 मिमी/मिनट के वेग से अगले नमूना contiainer के लिए सुई ले जाएँ
जी0 एफ100 जेड0 नमूना कंटेनर में उसी जेड-स्थिति में कम सुई जहां मुद्रण 100 मिमी/मिनट के वेग से शुरू हुआ
जी 1 एफ 1 एक्स 96.01 वाई 81.0 ई 0.3 बायोइंक के 20 माइक्रोन को 50 माइक्रोन/मिनट की फ़ीड दर पर मैट्रिक्स में निकालें जहां वर्तमान स्थिति निर्धारित की गई थी
जी0 एफ200 जेड60 200 मिमी/मिनट के वेग पर मैट्रिक्स और नमूना contianer से बाहर सुई खींचो
जी0 एफ500 एक्स126.21 वाई81.0 500 मिमी/मिनट के वेग से अगले नमूना contiainer के लिए सुई ले जाएँ
जी0 एफ100 जेड0 अगले नमूना कंटेनर में उसी जेड-स्थिति में कम सुई जहां मुद्रण 100 मिमी/मिनट के वेग से शुरू हुआ
जी 1 एफ 1 एक्स 126.21 वाई 81.0 ई 0.4 बायोइंक के 20 माइक्रोन को 50 माइक्रोन/मिनट की फ़ीड दर पर मैट्रिक्स में निकालें जहां वर्तमान स्थिति निर्धारित की गई थी
जी0 एफ200 जेड80 200 मिमी/मिनट के वेग पर मैट्रिक्स और नमूना contianer से बाहर सुई खींचो

तालिका 1: बैक्टीरियल निलंबन की ऊर्ध्वाधर रेखाओं को प्रिंट करने के लिए जी-कोड प्रोग्रामिंग।

पूरक फ़ाइल 1: नीचे क्लैंप के लिए एसटीएल फ़ाइल सिरिंज एक्सट्रूडर के लिए 1 एमएल डिस्पोजेबल ल्यूर लॉक सीरिंज। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 2: सिरिंज एक्सट्रूडर के लिए 1 एमएल डिस्पोजेबल ल्यूअर लॉक सीरिंज के लिए शीर्ष क्लैंप के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: सिरिंज एक्सट्रूडर के लिए 1 एमएल डिस्पोजेबल ल्यूर लॉक सीरिंज के लिए सिरिंज एडाप्टर के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: क्यूवेट नमूना धारक के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 5: ऊतक फ्लास्क नमूना धारक के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 6: 6-अच्छी प्लेट और 35 मिमी पेट्री डिश प्रिंट बेड के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 7: कण ट्रैकिंग के लिए कस्टम स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स तैयार करते समय, मैट्रिक्स एक बाँझ वातावरण में बनाया जाता है। यदि नहीं, तो संदूषण हो सकता है, जो कई दिनों के बाद मैट्रिक्स में माइक्रोकॉलोनियों (छोटे गोलाकार) के रूप में प्रकट होता है। मिश्रण प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि सभी सूखे दानेदार हाइड्रोजेल कण भंग हो जाएं। इसके अतिरिक्त, NaOH के साथ प्रत्येक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के पीएच को समायोजित करते समय, दाने सूजने लगेंगे, जिससे हाइड्रोजेल मैट्रिक्स की चिपचिपाहट बढ़ जाती है, जिससे मिश्रण अधिक कठिन हो जाता है। स्टैंड मिक्सर का उपयोग करने से यह सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी कि NaOH हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में अच्छी तरह मिलाया जाता है। प्रत्येक बैक्टीरियल निलंबन की लोडिंग के दौरान, सुई में हवा की जेब बन सकती है। इस समस्या से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि सुई की नोक हमेशा अपकेंद्रित्र ट्यूब में बैक्टीरिया के निलंबन में बैठी है और ट्यूब के नीचे या शीर्ष सतह के पास नहीं। इस मुद्दे को दूर करने का एक और तरीका कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में विकसित करना है और इस प्रकार मुद्रण के लिए बैक्टीरिया निलंबन की बड़ी मात्रा है।

सीमाओं
वर्तमान में, मुद्रण के दौरान, बैक्टीरियल निलंबन की कम चिपचिपाहट ज्यामिति को सीमित करती है जिसे मुद्रित किया जा सकता है और अक्सर ट्रेस कोशिकाओं के कारण हाइड्रोजेल मैट्रिक्स सतह के शीर्ष पर बायोफिल्म बनाने और बढ़ने की ओर जाता है। इस सीमा पर काबू पाने के लिए कुछ संभावित तरीके हैं, जिसमें बैक्टीरियल निलंबन की चिपचिपाहट बढ़ाना या 3 डी प्रिंटर सेटिंग्स को और अनुकूलित करना शामिल है। बैक्टीरियल निलंबन की चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए, एक और बहुलक के साथ बैक्टीरियल निलंबन मिश्रण कर सकता है - उदाहरण के लिए, alginate, जो फ्लैट सतहों38 पर बैक्टीरिया की 3 डी प्रिंटिंग के लिए पहले इस्तेमाल किया गया है. प्रिंटर सेटिंग्स आगे दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स, जो हाइड्रोजेल मैट्रिक्स से सुई को हटाने के दौरान जमा किया जा रहा से कोशिकाओं को रोकने की क्षमता होगी से सुई की वापसी के दौरान सिरिंज सवार की वापसी को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व
यहां वर्णित विधि बैक्टीरिया कालोनियों को दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस में प्रिंट करने की अनुमति देती है। दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस बैक्टीरिया की गतिशीलता और विकास पर बाहरी पर्यावरणीय कारकों (जैसे, ताकना आकार, मैट्रिक्स विकृति) के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, इस काम में, एलबी का उपयोग हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को प्रफुल्लित करने के लिए तरल विकास माध्यम के रूप में किया जाता है, हाइड्रोगेल मैट्रिक्स को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया सहित अन्य तरल विकास मीडिया के साथ सूजन किया जा सकता है। सीमित वातावरण में बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए पिछले तरीकों प्रयोगात्मक समय की लंबाई, बहुलक जाल आकार, और आसपास हाइड्रोजेल मैट्रिक्स कठोरता37,38 से सीमित थे. विभिन्न पॉलिमर से दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस बनाने के लिए प्रोटोकॉल पहले से मौजूद हैं, इसलिए बैक्टीरिया की गतिशीलता और विकास पर विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रभावों का अध्ययन करने की क्षमता बहुत बड़ी है। यह विधि नियंत्रण वातावरण में बैक्टीरिया के अध्ययन की अनुमति देती है जो वास्तविक दुनिया में रहने वाले वातावरणों को अधिक आसानी से पुन: व्यवस्थित करती है, जैसे कि मेजबान बलगम या मिट्टी। कई अन्य तरीकों की एक और सीमा आसपास के मैट्रिक्स की अस्पष्टता है; हालांकि, ऑप्टिकली पारदर्शी सामग्री का उपयोग करके यह दृष्टिकोण 3 डी में बैक्टीरिया के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण और पैटर्निंग का पता लगाने की क्षमता प्रदान करता है।

गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने से परे, यहां वर्णित 3 डी प्रिंटिंग विधि कई अन्य बायोप्रिंटिंग विधियों की सीमा को पार करती है जिनके लिए एक सब्सट्रेट पर बायोइंक के जमाव की आवश्यकता होती है और इसलिए, इंजीनियर जीवित सामग्री की ऊंचाई में सीमित होती है जो वे उत्पादन कर सकते हैं। भविष्य में, इस बायोप्रिंटिंग प्रोटोकॉल को बायोफिल्म बनाने वाली कोशिकाओं के साथ पॉलिमर को मिलाकर बायोहाइब्रिड सामग्री बनाने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है। दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस 3 डी प्रिंटिंग मोटी, बड़े पैमाने पर इंजीनियर जीवित सामग्री और कई अन्य मौजूदा बैक्टीरिया बायोप्रिंटिंग विधियों की तुलना में अधिक जटिल ज्यामिति के लिए समर्थन प्रदान करते हैं। जबकि इस काम में केवल वी. कोलेरा और ई. कोलाई का उपयोग किया गया था, अन्य प्रजातियां, जैसे कि स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, भी सफलतापूर्वक37 डी मुद्रित की गई हैं। मुद्रण से परे, प्रिंटर को विकास के बाद बैक्टीरिया के नियंत्रित नमूने को देखने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि क्या कोई आनुवंशिक परिवर्तन हुआ है, उदाहरण के लिए।

Disclosures

इस प्रकाशन में 3डी प्रिंट और इमेज बैक्टीरियल समुदायों के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रायोगिक मंच प्रिंसटन विश्वविद्यालय द्वारा तपोमॉय भट्टाचार्जी और एसएसडी (पीसीटी आवेदन संख्या पीसीटी/यूएस/2020/030213) की ओर से दायर पेटेंट आवेदन का विषय है।

Acknowledgments

आरकेबी राष्ट्रपति पोस्टडॉक्टोरल रिसर्च फेलो प्रोग्राम से समर्थन स्वीकार करता है। यह सामग्री एनएसएफ ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम ग्रांट डीजीई-2039656 (एएमएच के लिए) द्वारा समर्थित कार्य पर भी आधारित है। ए.एस.डी.-एम. और एचएनएल प्रिंसटन विश्वविद्यालय में लिडो इंडिपेंडेंट वर्क / सीनियर थीसिस फंड से समर्थन स्वीकार करते हैं। हम वी हैजा के उपभेदों को प्रदान करने के लिए बोनी बेसलर की प्रयोगशाला को भी धन्यवाद देते हैं। S.S.D. NSF अनुदान CBET-1941716, DMR-2011750, और EF-2124863, साथ ही एरिक और वेंडी श्मिट ट्रांसफॉर्मेटिव टेक्नोलॉजी फंड, न्यू जर्सी हेल्थ फाउंडेशन, प्यू बायोमेडिकल स्कॉलर्स प्रोग्राम और केमिली ड्रेफस शिक्षक-विद्वान कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL cuvettes VWR 97000-586
1 mL Luer lock syringe BH Supplies BH1LL
10 M NaOH Sigma-Aldrich 72068
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres)   Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)
F8803
15 mL centrifuge tubes ThermoFischer Scientific 14-955-237
20 G blunt needle McMaster Carr 75165A252
25 mL tissue culture flasks VWR 10861-566
3D printer Lulzbot LulzBot Mini 2
3D printing software Cura Cura-Lulzbot
50 mL centrifuge tubes ThermoFischer Scientific 14-955-239
Agar Sigma-Aldrich A1296
Carbomer Granular Hydrogel Particles Lubrizol  Carbopol 980NF dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers
Centrifuge (2 mL tube capacity) VWR 2405-37
Centrifuge (50 mL tube capacity) ThermoFischer Scientific 75007200 Sorvall (brand) ST 8 (model)
Confocal Microscope Nikon A1R+ inverted laserscanning
confocal microscope
Glass bottom petri dish Cellvis D35-10-1-N
Lennox LB (Lubria Broth) Sigma-Aldrich L3022
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap McMaster Carr 91290A478
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut McMaster Carr 93187A300
Open-source syringe pump Custom-made Replistruder 4 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791
Petri dish (60 mm round) ThermoFischer Scientific FB0875713A
Shear Rheometer Anton Paar MCR 501
Ultrasonic cleaner VWR 97043-992

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References

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