袖带技术在小鼠原位肝移植中的血管重建

Summary

该协议为在小鼠原位肝移植中使用袖带技术进行血管重建提供了技术信息。

Abstract

小鼠原位肝移植是研究肝缺血和再灌注损伤潜在机制的有效方法。然而，技术挑战对利用这种宝贵的实验模型并将这些技能传授给下一代构成了障碍。该手术最具挑战性的方面是血管重建，包括门静脉 （PV）、肝下下腔静脉 （IHIVC） 和肝上下腔静脉。使用塑料袖带而不是缝合线，可以更顺利地进行 PV 和 IHIVC 重建。通过将由静脉导管制成的袖带连接到移植物血管的尖端并将袖带插入受体血管来重建血管。两个最关键的方面是正确地观察血管的内腔和避免使用过度的力。我们的目标是提供在接受者手术中使用袖带技术进行血管重建的技术概述。这些袖带技术的技术技巧有望帮助显微外科医生促进血管重建并推进他们的研究。

Introduction

小鼠原位肝移植（MOLT）是一种有效的实验方法，于1991年首次报道¹。这种利用转基因小鼠和各种研究试剂的实验模型在研究冷暖缺血和再灌注损伤方面发挥了关键作用。然而，该模型的高技术复杂性阻碍了肝移植基础医学的发展^2。MOLT 涉及三个主要步骤:（1） 从供体小鼠中取出肝脏，（2） 背台手术，以及 （3） 将肝脏植入受体。在这些受体手术中，血管吻合术构成了最大的挑战。虽然肝上下腔静脉吻合术通常通过手工缝合完成²，但肝下下腔静脉 （IHIVC） 和门静脉 （PV） 可以使用塑料袖带代替手工缝合线更有效地重建。

肝期表示切除受体的天然肝脏和移植物植入之间的间隔。为确保一致的结果，必须将肝脏分离时间限制在20分钟以内。因此，采用这一模式的研究仅限于^特定机构3,4,5,6,7,8,9。....

Protocol

该实验方案得到了京都大学动物实验委员会的批准。该研究使用了从商业来源获得的 C57BL/6 小鼠，年龄超过 10 周，体重在 25 g 至 30 g 之间（参见 材料表）。所有动物均用2.5%异氟烷麻醉（遵循机构批准的方案），在特定的无病原体条件下维持，所有实验程序均按照京都大学的《动物实验条例》进行。用于研究的适当仪器列在 材料表 中，如图 1 和 图 2 所示。

1. 动物选择

1. 使用体重为25-30克的小鼠。
   注意:虽然小鼠肝脏同种异体移植物² 在主要组织相容性复合物屏障中被普遍接受，但我们在这项研究中选择了同基因 MOLT 模型，以关注冷缺血再灌注损伤¹⁰ 的详细机制。不建议使用体重小于 25 g 的小鼠，因为不可能将内部支架插入细胆管。同样，由于血管周围存在大量腹内脂肪，因此不建议体重超过 30 克的小鼠。

2. 袖口制作

1. 分别为 PV 和 IHIVC 准备 20 G 和 16 G 静脉导管。

Results

当松开门静脉时，没有迂曲，肝脏均匀灌注时，PV 重建成功。肝功能时间应小于20分钟，因为肝脏时间超过25分钟会增加小鼠死亡的风险。如果移植物没有血液反流，则认为 IHIVC 重建成功。

使用器官保存溶液在低温下储存移植物1小时，导致再灌注后6小时的血清丙氨酸氨基转移酶水平约为2,000U / L（图7A）。移植后7天的存活率为100%（图7B）。然而，在没有肝动脉吻合术的情况下，受体小鼠可能会在移植后约 30 天死于肝内胆瘤相关问题

图 1:血管重建仪器。 根据情况.......

Discussion

学习血管重建是成功实现 MOLT 最具挑战性的方面。鉴于小鼠⁵ 的体型较小，袖带的质量显着影响了重建的难度。本文提供了袖带准备、连接和重建的详细方案。

虽然与以前的报告在袖带准备和连接方面没有重大差异 ^2,5，^但应考虑一些小问题。首先，袖带手柄的厚度应限制在总周长的 1/6 左右。如果太薄，手柄很容易弯曲并变得难以抓握。如果它太厚，在接受者的腹部处理可能会很困难。尽早确定您的个人偏好至关重要。

其次，后桌管腔的可见性至关重要。使用 10-0 尼龙线，连接到供体的脾静脉作为标志以确认 PV 管腔。尼龙线放置在 8 点钟位置，以防止过度扭曲。通过在3点钟和9点钟位置用两把镊子抓住它，并在6点钟位置将其压在袖壁上，使血管壁外化。以8-0的比分定格丝线需要小心的动作。通过将其固定在凹槽中，可以实现充分的固定。安装后，提起袖带以确认其没有脱落。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G 静脉导管	TERUMO	SR-FF2032	IHIVC 袖带
20 G 静脉导管	TERUMO	SR-FF1651	PV 袖带
8-0 编织丝	夏目制作所	CR9-80B2	8-0 丝
Belzer UW 冷藏解决方案	安斯泰来		器官保存液
Bulldog 夹	B BRAUN	FB329R	Bulldog 夹
C57BL/6 小鼠	Oriental Bio Service
异氟醚吸入溶液	Viatris		麻醉
微钝头 0.1 毫米 x 0.06 毫米	FST	11253-20	直型微镊
微型 Serrefine 夹式胶枪	F.S.T	18056-14	容器夹式胶枪
Micro Serrefines	F.S.T	18055-4	容器夹
No.11 备用刀片	FEATHER 安全剃须刀	11	刀片
剪刀，圆柄	B BRAUN	FD103R	微型剪刀
塑料矩形容器	大创		10 cm 长、15 cm 宽、6 cm 高
SuperGrip 尖端	F.S.T	00649-11	弯曲的显微镊子
SZX7	奥林巴斯	SZX7
显微镜虎钳	Niigataseiki	00505351	鹅卵笔镊固定在工作台上的机械工具