我们描述了一种从冻存的诱导多能干细胞来源的基质/内皮细胞和血细胞类型中提取高质量细胞核的方案，以支持单细胞核下一代测序分析。获得高质量且完整的细胞核对于多组学实验至关重要，但对部分实验室而言，这可能构成进入该领域的技术障碍。
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本文内容
摘要
摘要
基于诱导性多能干细胞（iPSC）的模型是研究血液发育的优良平台，且iPSC衍生的血细胞在临床检测试剂和可输注细胞治疗产品方面具有转化应用价值。多组学分析技术的发展与拓展，包括但不限于单细胞核RNA测序（snRNAseq）和转座酶可及染色质测序（snATACseq），有望彻底改变我们对细胞发育过程的理解。这涵盖了发育生物学领域的研究应用 体外 造血模型。然而，从培养细胞或原代细胞中分离完整细胞核在技术上具有挑战性。不同细胞类型通常需要根据细胞的刚性和内容物特性定制相应的细胞核制备方法。这些技术难题可能限制数据质量，并阻碍有意开展多组学研究的研究人员。由于细胞采集和/或处理的限制，样本通常需要冷冻保存，而冻存样本在完整细胞核分离过程中可能带来额外的技术挑战。本文中，我们提供了一种详细的方法，用于从不同分化阶段的iPSC来源细胞中分离高质量细胞核 体外 造血发育在单核多组学工作流程中的应用。本方法开发的重点是分离由iPSC衍生的贴壁基质/内皮细胞以及非贴壁造血祖细胞的细胞核，因为这些细胞在结构和细胞特性方面代表了截然不同的细胞类型。所描述的故障排除步骤可有效减少细胞核聚集和碎片，从而获得足够数量和质量的细胞核用于后续分析。类似方法可经调整后用于从其他冷冻保存的细胞类型中分离细胞核。
引言
造血作用是一个相对研究较为清楚的发育系统，但目前仍无法完全重现血细胞的形成过程 体外 对相关因素的理解尚不完整。基于诱导多能干细胞（iPSC）的造血模型有助于阐明关键的发育因子及相关生物学机制。iPSC 系统还为研究血液疾病提供了优良的模型，且已利用 iPSC 衍生的血细胞开发出具有转化医学和治疗应用价值的试剂1,2,3,4单细胞研究已被广泛用于探究基于iPSC的发育生物学，包括造血过程中产生的细胞类型5与无法推断细胞亚群之间关系的批量RNA测序相比6单细胞多组学技术能够评估细胞异质性，并有助于细胞发育的鉴定与表征6,7.
iPSCs 形成造血细胞需要依次经过原始条纹、中胚层和内皮细胞阶段，最终生成生血性内皮细胞。生血性内皮细胞是造血干细胞和祖细胞的直接前体。8这些细胞类型具有显著不同的形态学和细胞特性。目前对表观遗传景观及发育动态的理解仍然有限 ....
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方案
1. 细胞的冷冻保存
- 冷冻 >1 × 106 每毫升含分离的iPSC来源细胞，加入1 mL 90% FBS和10% DMSO。将冻存管置于-80°C冷冻容器中，以降低冷冻速度，优化活细胞回收率（材料表）。预计会有显著的细胞损失，损失程度可能因培养条件和细胞类型而异。
- 在24小时内从-80°C转移至液氮中保存。
2. 细胞解冻
- 从液氮储存中取出冻存管，在37 °C水浴中解冻2分钟。当仍可见少量冰晶时，立即从水浴中取出。
- 将细胞从冻存管转移至一个空的15 mL离心管中，边轻轻混匀边缓慢加入10 mL预热的培养基（RPMI 1640 + 10% FBS）。在25 °C下以400 × g 离心3分钟。
- 吸除上清液，用1 mL添加了2% FBS和1 mM CaCl2 的DPBS（材料表）重悬细胞。使用1000 µL移液器轻轻吹打混匀3次。转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底试管中。
3. 去除死细胞
- 向1 mL细胞悬液中加入50 µL死细胞去除....
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结果
我们采用上述方案从冻存的iPSC来源的贴壁基质/内皮细胞以及非贴壁（悬浮）造血祖细胞中提取细胞核。细胞核分离步骤的详细示意图见图1。
为了进行形态学检查，分离的细胞核用台盼蓝染色，并在显微镜下观察。在处理前必须立即进行细胞核形态学检查，因为碎片或成团的细胞核可能导致精密微流控仪器发生堵塞，从而降低数据质量或无法获得有效数据。图2A-B显示了使用常规试剂盒方案制备的样本中分离出的细胞核，显微镜检查发现存在碎片以及每个视野中至少有一个细胞核聚集体。由于质量较差，这些样本被弃用。
高质量的细胞核呈圆形且完整，几乎无团块或无团块，例如我们在方法优化后观察到的结果（图 2C-D）。在这些样本中，我们未观察到任何聚集体或成团现象。这些细胞核在质量和数量上均足以支持后续的处理与分析。类似的故障排查.......
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讨论
方案中的关键步骤
分离高质量的细胞核对于当前基于单细胞核的下一代测序技术的成功实施至关重要，而这些技术正在迅速发展。鉴于对这些方法感兴趣的实验室目前仍面临诸多障碍，特别是针对冷冻保存样本的情况，我们的目标是开发一种专门适用于先前冷冻细胞的细胞核分离技术。对于临床样本以及稀有的诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞群体，从冷冻保存的样本中分离细胞核通常是必要的。
针对特定的细胞群体，优化裂解缓冲液的稀释比例、裂解时间以及过滤次数至关重要。我们观察到某些特别敏感的细胞类型，例如冻存的人诱导多能干细胞来源的造血祖细胞，在使用1倍浓度裂解缓冲液的情况下，不到一分钟即可能发生过度裂解。这种过度裂解不仅仅是一种技术或操作上的失误，反而可能提示黏附性核物质的泄漏。对于具有强健细胞骨架结构和易于形成牢固细胞间黏附的贴壁基质细胞和内皮细胞，需要进行两次过滤才能有效去除聚集的细胞核。核物质的聚集体可能堵塞微流控通道，对实验的完整性构成实际风险，甚至可能导致无法获得任何数据结果。
我们还发现，加入死细胞去除.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 Jason Hatakeyama（10x Genomics）和 Diana Slater（费城儿童医院应用基因组学中心）提供的指导与建议。本研究由美国国立卫生研究院（HL156052，资助对象：CST）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞培养试剂 | |||
| 二甲基亚砜溶液（DMSO） | Sigma | 673439 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | 康宁 | 21031CV | |
| 胎牛血清（FBS） | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI 1640 培养基（1X） | Gibco | 11875093 | |
| <强>细胞 | |||
| 诱导性多能干细胞 | N/A | N/A | 本研究中使用的诱导多能干细胞（iPSCs）通过费城儿童医院人类多能干细胞核心设施获得 |
| <强>细胞染色试剂 | |||
| 台盼蓝溶液 | 康宁 | 25900CI | |
| <强>死细胞去除试剂 | |||
| 氯化钙（CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep 死细胞去除（Annexin V）试剂盒 | StemCell Technologies | 17899 | 该试剂盒用于去除经生物素标记的非目标细胞类型。试剂盒包含死细胞去除（Annexin V）混合液、生物素筛选混合液以及葡聚糖磁珠。该试剂盒利用Annexin V靶向结合凋亡细胞质膜外小叶上的磷脂酰丝氨酸。非目标细胞通过Annexin V、生物素化抗体及磁性颗粒进行标记，并使用EasySep磁铁在无柱条件下实现分离。目标细胞可直接倾入新离心管中收集。 关键词：试剂盒，生物素，细胞去除，死细胞清除，Annexin V，磷脂酰丝氨酸，凋亡细胞，生物素化抗体，磁珠分离，EasySep磁铁，非目标细胞，目标细胞 |
| <强>材料 | |||
| 10 µ微量移液器 | Wards Science | 470231606 | |
| 100 µ微量移液器 | Wards Science | 470231598 | |
| 1000 µl 加长型通用吸头 | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µ微量移液器 | Wards Science | 470231602 | |
| 2.0 ml 冻存管 | 康宁 | 431386 | |
| 20 µ微量移液器 | Wards Science | 470231608 | |
| 200 µ微量移液器 | Wards Science | 470231600 | |
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µ移液器吸头架 | 康宁 | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ移液器吸头架 | 康宁 | 4144 | |
| 计数室 | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi 细胞筛，40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| 磁铁 | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE 冻存管 1°C 冻存容器 | Nalgene | 51000001 | |
| <强>细胞核分离试剂 | 细胞核分离试剂包括裂解缓冲液， 洗涤缓冲液、稀释核缓冲液和裂解稀释缓冲液。这些缓冲液的组成见表1、表2和表3。我们的细胞核分离方法相较于标准试剂盒方案有所改进（例如，10x Genomics Chromium Next GEM 单细胞多组学ATAC + 基因表达用户指南 [CG000338]）。本方案可与多种商业试剂盒联合使用，包括Chromium Next GEM 单细胞多组学ATAC + 基因表达试剂套装，16次反应（PN-1000283）。 | ||
| 死细胞去除试剂盒 | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | 赛默飞世尔科技 | BN2006 | |
| DL-二硫苏糖醇溶液（DTT） | Sigma | 646563 | |
| Flowmi 细胞筛，40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS 牛血清白蛋白（BSA）储备液 | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| 氯化镁（MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| 1 M 氯化镁溶液 | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 替代品 | Sigma | 74385 | |
| 无核酸酶水 | 赛默飞世尔科技 | AM9937 | |
| 细胞核缓冲液（20X） | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase抑制剂 | Sigma | 3335399001 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma | S7653-250G | |
| 5 M 氯化钠溶液 | Sigma | 59222C | |
| Trizma 盐酸盐溶液，pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma盐酸盐（Tris-HCl）（pH 7.4） | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | 伯乐（Bio-Rad） | 1662404 | |
| <强>其他设备 | |||
| 自动细胞计数仪 | CytoSMART | 699910591 | |
| 显微镜 | 蔡司 | Primostar 3 |
参考文献
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine.....
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