Ontwikkeling van een klinisch relevant hemorragisch shockmodel bij ratten

Summary

Hemorragische shock doodt elk jaar wereldwijd 1,9 miljoen mensen. Kleine dieren worden vaak gebruikt als hemorragische shockmodellen, maar worden geassocieerd met problemen op het gebied van standaardisatie, reproduceerbaarheid en klinische significantie, waardoor hun relevantie wordt beperkt. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een nieuw klinisch relevant hemorragisch shockmodel bij ratten.

Abstract

In de afgelopen decennia heeft de ontwikkeling van diermodellen ons in staat gesteld om verschillende pathologieën beter te begrijpen en nieuwe behandelingen te identificeren. Hemorragische shock, d.w.z. orgaanfalen als gevolg van snel verlies van een grote hoeveelheid bloed, wordt geassocieerd met een zeer complexe pathofysiologie waarbij verschillende routes betrokken zijn. Talrijke bestaande diermodellen van hemorragische shock streven ernaar om te repliceren wat er bij mensen gebeurt, maar deze modellen hebben grenzen in termen van klinische relevantie, reproduceerbaarheid of standaardisatie. Het doel van deze studie was om deze modellen te verfijnen om een nieuw model van hemorragische shock te ontwikkelen. Kort gezegd werd hemorragische shock geïnduceerd bij mannelijke Wistar Han-ratten (11-13 weken oud) door een gecontroleerde verbloeding die verantwoordelijk was voor een daling van de gemiddelde arteriële druk. De volgende fase van 75 minuten was het handhaven van een lage gemiddelde arteriële bloeddruk, tussen 32 mmHg en 38 mmHg, om de pathofysiologische routes van hemorragische shock op gang te brengen. De laatste fase van het protocol bootste de patiëntenzorg na met een toediening van intraveneuze vloeistoffen, Ringer Lactaat-oplossing, om de bloeddruk te verhogen. Lactaat- en gedragsscores werden 16 uur na het starten van het protocol beoordeeld, terwijl hemodynamische parameters en plasmatische markers 24 uur na het letsel werden geëvalueerd. Vierentwintig uur na inductie van hemorragische shock was de gemiddelde arteriële en diastolische bloeddruk verlaagd in de hemorragische shockgroep (p < 0,05). Hartslag en systolische bloeddruk bleven onveranderd. Alle markers voor orgaanschade waren verhoogd met de hemorragische shock (p < 0,05). De lactatemie- en gedragsscores waren verhoogd in vergelijking met de schijngroep (p < 0,05). Concluderend hebben we aangetoond dat het hier beschreven protocol een relevant model van hemorragische shock is dat in latere studies kan worden gebruikt, met name om het therapeutisch potentieel van nieuwe moleculen te evalueren.

Introduction

Hemorragische shock (HS) is een shocktoestand die wordt gekenmerkt door aanzienlijk verlies van bloedvolume, resulterend in weefseldysoxie. HS is een complexe pathologie die hemodynamische en metabolische veranderingen associeert, samen met pro- en anti-inflammatoire reacties. Elk jaar worden wereldwijd ongeveer 1,9 miljoen sterfgevallen toegeschreven aan de bloeding en de gevolgen^ervan1. De huidige richtlijnen voor de zorg hebben voornamelijk betrekking op intraveneuze vloeistoftoediening (al dan niet aangevuld met vasoactieve moleculen) en zuurstoftherapie. Deze behandelingen zijn echter symptomatisch en kunnen ineffectief zijn, wat verklaart waarom de HS-geassocieerde mortaliteit hoog blijft². Dit rechtvaardigt het belang van het identificeren van nieuwe moleculaire en cellulaire mechanismen en dus behandelingen om de mortaliteit te verminderen.

Diermodellen maken het mogelijk om de pathofysiologische mechanismen die betrokken zijn bij ziekten te ontcijferen en nieuwe therapeutische strategieën te testen. Er bestaan talloze diermodellen van hemorragische shock in de literatuur. Deze modellen verschillen niet alleen in de gebruikte soorten, maar ook in de middelen om HS te induceren (bijv. vaste druk versus vast volume) (Tabel 1, Tabel 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Ook variëren protocollen binnen hetzelfde type model (bijv. tijdstip van bloeding, gerichte gemiddelde arteriële druk) (tabel 3)14,15,16,17,18,19,20. Gezien de grote verscheidenheid aan bestaande hemorragische shockmodellen en de complexiteit van het repliceren van de klinische situatie, blijft de preklinische studie van deze pathologie beperkt. De ontwikkeling van een reproduceerbaar, standaardiseerbaar en eenvoudig te implementeren hemorragisch schokmodel is in ieders belang. Dit zou de vergelijking tussen de verschillende studies vergemakkelijken en zo de complexe pathofysiologie van de hemorragische shock ontrafelen. Het doel van dit protocol was om een nieuw klinisch relevant model van hemorragische shock bij ratten te ontwikkelen met behulp van twee opeenvolgende fasen van bloeding met een vast volume, gevolgd door een vaste fase van lage bloeddruk.

Tabel 1: Soorten gebruikt als model voor hemorragische shock 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: De verschillende soorten hemorragische shock¹³. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Voorbeeld van de diversiteit van experimentele modellen van hemorragische shock bij ratten geïnduceerd door een vast drukprotocol. Samenvatting van parameters voor verschillende experimentele modellen van hemorragische shock. Bloedvaten die in het rood worden weergegeven, zijn slagaders en die in het blauw zijn aders. Voor reanimatie wordt het volume bloed dat wordt bemonsterd als referentie gebruikt (bloed: reanimatie met een volume dat identiek is aan dat van bloed dat tijdens shock wordt bemonsterd; x2: reanimatie met een volume dat tweemaal zo groot is als bloed dat tijdens shock wordt bemonsterd; x4: reanimatie met een volume dat vier keer zo groot is als bloed dat tijdens shock wordt bemonsterd). MAP: gemiddelde arteriële druk; RL: Ringer lactaat 14,15,16,17,18,19,20. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de regionale ethische commissie (protocol (#17858 en #32499, CEEA-Pays de la Loire, Frankrijk) volgens Richtlijn 2010/63/EU van de Europese Unie. De rapportage is in overeenstemming met de huidige ARRIVE-richtlijnen en de National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Pub. No. 85-23, herzien in 2011). 1. Ethische status en algemene informatie over ratten Mannelijke Wistar Han-ratten (Charles River, Saint-Germain-Nuelles, Frankrijk) werden op een leeftijd van 10 weken afgeleverd bij de Unité Thérapeutique Expérimentale. Huisvest de ratten minimaal 1 week onder standaardtemperatuur (21-24 °C), vochtigheid (40%-60%) en 12 uur licht/donkercyclus met een lichtperiode die begint om 07:30 uur. Zorg voor voedsel en water ad libitum. Gebruik ratten van 11-13 weken oud met een gewicht van 300-400 g voor het protocol. 2. Stappen voor het instellen en voorbereiden van de ruimte Schakel het anesthesiestation in, stel de verwarmingsmat in op 37,5 °C en dek deze af met een niet-steriel laken. Steriliseer de chirurgische instrumenten die nodig zijn voor het protocol: DeBakey atraumatische pincet (1), fijne en scherpe schaar of scalpel (1), standaard patroontang (2), naaldhouders (1), Vannas micro-ontleedschaar (1), klem (1). Bereid katheters voor op de halsader en de dijbeenslagader.Monteer voor de halsaderkatheter de slang van polyethyleen (PE) (PE50) op een naald van 23 G waarvan de punt aan het uiteinde is afgesneden. Bereid voor de katheter van de dijbeenslagader de katheter voor die is beschreven in stap 2.3.1 en bevestig een PE10-slang aan het uiteinde van de PE50-slang. Bereid de druktransducer en katheters voor op de dijbeenslagader en halsader door deze te vullen met Ringer-lactaatoplossing gehepariniseerd bij 100 UI/ml. Plaats een spuit van 2 ml met Ringer-lactaatoplossing met heparinisme van 100 UI/ml aan het uiteinde van de katheters en de druktransducer. Pas op dat er geen luchtbellen ontstaan, omdat deze signaaldefecten veroorzaken. Schakel de software in die bij de drukopnemer hoort en kalibreer deze volgens de instructies van de leverancier. 3. De rat voorbereiden op een operatie Verdoof de rat met een inductiebox (parameters: sevofluraan 8%, luchtdebiet: 1 l/min). Na controle van de diepte van de anesthesie via pedaalreflex, houdt u de anesthesie aan op sevofluraan 4%, met een luchtdebiet van 0,6 l/min. Het preoperatief gebruik van pijnstillers werd vermeden vanwege de hemodynamische effecten van deze moleculen.OPMERKING: Vanaf deze stap wordt elke 20 minuten de diepte van de anesthesie beoordeeld via pedaalreflex. Weeg de rat, plaats hem in de dorsale decubituspositie op een verwarmingsmat en onthaar hem bij de lies- en nekregio’s. Desinfecteer onthaarde gebieden met afwisselend 10% en 4% povidon-jodiumoplossingen (elk 3 keer) met behulp van niet-steriele gaasjes. Breng een druppel oogzalf aan op de ogen van het dier om uitdroging te voorkomen. Leg de rat op een verwarmingsmat op de operatietafel (dorsale decubitus). Plaats de gesmeerde rectale sonde om de temperatuur van de rat te regelen. Handhaaf de anesthesie op sevofluraan 4%, met een luchtdebiet van 0,6 l/min. Vervang handschoenen door steriele, plaats het steriele laken op de rat en snijd het bij de lies- en nekregio’s. 4. Cannulatie van de halsader Lokaliseer het halsslagadergebied in het nekgebied rechtsonder, boven het sleutelbeen, door zichtbare pulsatie. Gebruik de DeBakey atraumatische pincet, pak de huid voorzichtig vast en maak vervolgens een precieze incisie met een fijne, scherpe schaar of een scalpel. Breng een druppel plaatselijke verdoving (lidocaïne 2%) aan op het ingesneden gebied. Snijd voorzichtig in het weefsel met een standaard patroontang. Lokaliseer de halsader en bevrijd deze voorzichtig uit het spiercompartiment met een standaardpatroontang. Plaats een 4/0 zijden hechtdraad en maak de distale zijde stevig vast (naar het hoofd toe). Gebruik de hechtdraad met de naaldhouders om de halsader te spannen. Plaats een 4/0 hechting aan de proximale zijde (naar het hart) en bereid een chirurgische knoop voor zonder deze aan te spannen. Maak een kleine incisie in de halsader met behulp van een Vannas micro-ontleedschaar. Nadat u de aderwand voorzichtig met een kleine pincet hebt vastgepakt, plaatst u de PE50-katheter met de hand of met een pincet met een standaardpatroon in de halsader. Gebruik in dit stadium een steriel gaasje om eventuele bloeddruppels af te vegen, die uit de ader kunnen lekken. Schuif de katheter iets naar voren (0,5 cm) en controleer de juiste plaatsing in de ader door een kleine hoeveelheid bloed af te nemen en vervolgens opnieuw te injecteren (bloed in de canule geeft aan dat het in de ader zit). Draai de eerder voorbereide knoop vast om de katheter vast te zetten. Laat de katheter op zijn plaats, bevestigd aan een spuit die vooraf is gevuld met Ringer-lactaatoplossing, en bedek het ingesneden gebied met een bevochtigd steriel gaasje. 5. Cannulatie van de dijbeenslagader Gebruik DeBakey atraumatische pincet om de huid van de Scarpa-driehoek van het linkerbeen vast te pakken en maak een incisie met een fijne en scherpe schaar of een scalpel. Breng een druppel plaatselijke verdoving (lidocaïne 2%) aan op het ingesneden gebied. Scheur het weefsel voorzichtig weg met een standaard patroontang. Lokaliseer de femurtriade (slagader, ader en zenuw). Steek een pincet onder de drieklank door en scheid met behulp van de tweede standaardpatroontang heel voorzichtig de slagader van de zenuw en de dijbeenader.OPMERKING: De slagader is kleiner, roze en pulserend. Dit is een cruciale stap; De ader en slagader zijn kwetsbaar en kunnen gemakkelijk scheuren. Plaats een 4/0 hechting en ligate de dijbeenslagader distaal (beenzijde). Neem de hechting met de naaldhouders om de dijbeenslagader op spanning te brengen. Plaats een 4/0 hechting aan de proximale zijde (hartzijde) en bereid een knoop voor zonder deze te sluiten. Klem de slagader af (plaats de klem stroomopwaarts van de proximale zijhechting). Snijd de dijbeenslagader dwars in met een Vannas micro-ontleedschaar (er moet een kleine hoeveelheid bloed uit de slagader stromen). Pak met een standaardpincet de slagaderwand voorzichtig vast en kanungel de dijbeenslagader met de katheter (PE10 uiteindelijk), waarbij u deze met een pincet vasthoudt. Maak de klem voorzichtig los om te controleren op lekken en controleer vervolgens het druksignaal (bevestigt dat de katheter zich in de dijbeenslagader bevindt) en controleer of er geen bloed terugstroomt in de katheter (teken van lekkage uit de kleppen/druktransducer). Als het signaal goed is (verwachte waarden: systolische bloeddruk: 120 mmHg, diastolische bloeddruk: 80 mmHg) en er geen tekenen van lekkage zijn, schuif dan de katheter iets naar voren (0,5 cm) en draai de eerder voorbereide chirurgenknoop aan. Hepariniseer het dier bij 100 UI/kg en breng een bevochtigd steriel gaasje aan op het ingesneden gebied. Na de operatie de anesthesie handhaven op sevofluraan 3% bij een luchtdebiet van 0,6 l/min. 6. Protocol voor hemorragische shock (figuur 1) Fase 1: Stabilisatie (5 min).Wacht na heparinisatie 10 minuten totdat de drukwaarden zijn gestabiliseerd. Maak een opname van 5 minuten voor basale hemodynamische waarden. Fase 2: Verbloeding (5 min):OPMERKING: Deze fase komt overeen met de fase met een vast volume van het model.Neem 5 ml bloed af uit de dijbeenslagader gedurende 5 minuten (500 μL/30 s) met behulp van een spuit van 1 ml (verwachte waarden: systolische bloeddruk: 45 mmHg, diastolische bloeddruk: 30 mmHg). Bereid een mengsel van 50% Ringer-lactaatoplossing met 50% opgevangen bloed bij kamertemperatuur. Doe het mengsel in een spuit van 2 ml en plaats deze aan het einde van de canule van de halsader. Fase 3: Hemorragische shock (75 min)OPMERKING: Deze fase is de fase met vaste druk van het model.Houd de gemiddelde arteriële druk op een gemiddelde van 35 mmHg. Wanneer de gemiddelde arteriële druk hoger is dan of gelijk is aan 38 mmHg, zuig dan 200 μL bloed af via de dijbeenslagader (gemiddelde op n = 12 ratten: 10,2 ml). Als de gemiddelde arteriële druk onder 32 mmHg daalt, injecteer dan 200 μl van een mengsel van 50% bloed-50% lactaatoplossing via de halsader (gemiddelde op n = 12 ratten: 0,90 ml). Meet perifeer bloedlactaat op een bloeddruppel vanaf het uiteinde van de staart met de punt van een naald (26 G) na steriele voorbereiding van de staart met een gaasje aan het einde van de hemorragische shockfase. Fase 4: Intraveneuze vloeistofreanimatie (20 min)Reanimeer met een Ringer-lactaatoplossing bij kamertemperatuur (RT) bij 10 ml/kg gedurende 20 minuten (stroomsnelheid van 10,5 ml/uur voor een rat van 350 g) met een spuit van 20 ml door de halsslagader met een spuitpomp. 7. Einde van de operatie en herstel en postoperatieve follow-up Klem de halsader en de dijbeenslagader af en verwijder de katheter. Ligger schepen. Controleer goed of er geen bloed naar buiten lekt. Voeg een druppel plaatselijke verdoving toe aan de ingesneden gebieden. Hecht ingesneden gebieden met onderhuidse en cutane hechtingen met behulp van 5-0 steriele hechtdraad. Desinfecteer met 10% povidon-jodiumoplossing. Injecteer buprenorfine (0,05 mg/kg, 0,3 ml/kg) subcutaan met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 26 G. Wacht tot de rat is gespeend van de anesthesie terwijl u de temperatuur controleert. Wanneer het tekenen van ontwaken vertoont (vibrissae bewegen, pootbewegingen), verwijder dan de rectale sonde en plaats de rat in zijn kooi op een verwarmingsmat. Breng de rat 10 minuten later terug naar zijn accommodatiekamer. Buprenorfine subcutaan (0,05 mg/kg, 0,3 ml/kg) elke 8 uur toedienen. Evalueer de ademhalingsfrequentie, het gedrag, de temperatuur en het bloedlactaat 16 uur na hemorragische shockinductie, zoals beschreven in stap 6.3. Figuur 1: Model van gemengde hemorragische shock bij ratten. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 8. 24 uur na hemorragische shockinductie Verdoof het dier zoals beschreven in stap 3.1. Leg het dier op de operatietafel en breng de rectale sonde in zoals beschreven in stap 3.5. Bereid de katheter voor op canulatie van de halsslagader zoals beschreven voor de halsader in stap 2.3 en 2.4. Gebruik DeBakey atraumatische pincet om de huid vast te pakken en maak een incisie in het midden van de nek met een fijne en scherpe schaar of een scalpel. Breng een druppel plaatselijke verdoving aan (lidocaïne 2%). Scheur het weefsel voorzichtig weg met een standaard patroontang. Scheid de speekselklieren en open vervolgens de tracheale spier om de tracheale ringen te onthullen. Neem de linker halsslagader en scheid deze van de zenuw met een standaardpatroontang (het is zeer waarschijnlijk dat de ademhaling van het dier zal versnellen). Maak de halsslagader distaal (hoofdzijde) los met 4/0 zijden draad. Plaats een hechtdraad aan de proximale zijde (hartzijde) en bereid een chirurgenknoop voor zonder deze te sluiten. Klem de slagader af (plaats de klem stroomopwaarts van de proximale zijhechting). Snijd de halsslagader in met een Vannas micro-ontleedschaar (er moet een kleine hoeveelheid bloed uit de slagader stromen). Pak met een pincet met een standaardpatroon de slagaderwand voorzichtig vast om de opening te vergroten en kanungel de halsslagader met de meegeleverde katheter, waarbij u deze met een pincet vasthoudt. Maak het druksignaal los en controleer het om de plaatsing van de katheter te bevestigen, en controleer of er geen bloed terugstroomt in de katheter (een teken van lekkage uit de kleppen/drukopnemer). Als het signaal goed is en er geen lekkage is, schuift u de katheter iets naar voren (0.5 cm) en draait u de eerder voorbereide chirurgenknoop vast en zet u deze vast. Hepariniseer het dier bij 100 UI/kg en breng een bevochtigd steriel kompres aan over de incisie. Na de operatie de anesthesie handhaven met sevofluraan 3% bij een luchtstroomsnelheid van 0,6 l/min. Wacht 10 minuten om 24 uur hemodynamische waarden te registreren (verwachte waarden: systolische bloeddruk: 120 mmHg, diastolische bloeddruk: 60 mmHg). Om plasmatische markers van orgaanschade te beoordelen, neemt u 1 ml bloed af uit de halsslagader en centrifugeert u gedurende 10 minuten bij 1600 x g . Aliquot en bewaar plasma voor verdere analyse. Offer de rat onmiddellijk na het meten van hemodynamische waarden na 24 uur en verzamel bloed.OPMERKING: De methode van euthanasie moet worden aangepast aan de specifieke parameters of monsters die daarna zullen worden verzameld. De schijngroep ondergaat alleen een operatie (secties 1-5, 7 en 8) zonder de procedure van hemorragische shock (sectie 6). Dieren werden door de onderzoeker willekeurig toegewezen tussen de schijn- en hemorragische shockgroepen. Alleen de onderzoeker was op de hoogte van de groepsindeling in de verschillende stadia van het experiment.

Representative Results

Volgens het hierboven beschreven protocol evalueerden we 24 uur na de inductie van de hemorragische shock verschillende hemodynamische parameters. De basale gemiddelde arteriële druk (vóór het begin van het hemorragische shockprotocol) is vergelijkbaar tussen de schijn- en hemorragische shockgroepen (figuur 2A). Zoals verwacht wordt de gemiddelde arteriële druk aanzienlijk verlaagd met het hemorragische shockprotocol, wat kan worden verklaard door de daling van de diastolische bloeddruk (Gemiddelde arteriële druk: Schijnvertoning: 92 mmHg ± 3 mmHg; HS: 82 mmHg ± 2 mmHg; Diastolische bloeddruk: 73 mmHg ± 3 mmHg; HS: 61 mmHg ± 2 mmHg) (Figuur 2B, C). Hemorragische shock heeft geen invloed op de systolische bloeddruk, polsdruk en hartslag (Figuur 2D-F). De schokindex (hartslag/systolische bloeddrukverhouding) en de gewijzigde schokindex (MSI) (hartslag/gemiddelde bloeddrukverhouding) zijn twee voorspellers van sterfte bij ernstige patiënten14,15. Hoe hoger de waarden, hoe groter het risico op sterfte. In dit model is de schokindex ongewijzigd tussen de twee groepen, terwijl de gewijzigde schokindex de neiging heeft toe te nemen in de hemorragische shock (MSI: Sham: 4,24 ± 0,11; HS: 4,70 ± 0,15) (Figuur 2G,H). Figuur 2: Impact van hemorragische shock op hemodynamische parameters. (A) basale gemiddelde arteriële druk, (B) gemiddelde arteriële druk, (C) diastolische bloeddruk, (D) systolische bloeddruk, (E) polsdruk, (F) hartslag, (G) schokindex en (H) gewijzigde schokindex tussen schijn- en hemorragische shockdieren. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische significantie werd beoordeeld door middel van een ongepaarde t-toets. *: p < 0,05; : p < 0,001. n = 6-12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Globale metabole stoornissen tijdens hemorragische shock kunnen worden beoordeeld door lactatemie. Zoals verwacht nam de lactatemie toe na het hemorragische shockprotocol en 16 uur erna (Einde van het protocol: Schijnvertoning: 1,13 mmol/L ± 0,14 mmol/L; HS: 5,98 mmol/L ± 0,39 mmol/L; H+16: Schijnvertoning: 1,95 mmol/L ± 0,23 mmol/L; HS: 2,95 mmol/L ± 0,19 mmol/L) (Figuur 3A,B). Temperatuur en ademhalingsfrequentie zijn twee componenten van het Systemisch Inflammatoir Respons Syndroom (SIRS), een pro-inflammatoire reactie die kenmerkend is voor de shocktoestand. Noch de temperatuur, noch de ademhalingsfrequentie worden 16 uur na de hemorragische schokinductie gewijzigd tussen de twee groepen (Figuur 3C,D). We evalueerden de impact van de hemorragische shock op een paar gedragsparameters zoals houding, activiteit, enz. (Aanvullend dossier 1). De gedragsscore is 16 uur na het protocol verhoogd in de hemorragische shockgroep (Sham: 0,33 ± 0,21; HS: 2,27 ± 0,69) (Figuur 3E). Figuur 3: Impact van hemorragische shock op lactatemie, temperatuur, ademhalingsfrequentie en gedragsscore. (A) Lactatemie aan het einde van het hemorragische shockprotocol, (B) lactatemie, (C) temperatuur, (D) ademhalingsfrequentie en (E) gedragsscore 16 uur na hemorragische shockinductie tussen schijn- en hemorragische shockdieren. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische significantie werd beoordeeld door middel van een ongepaarde t-toets. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 6-12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. De hemorragische shock wordt geassocieerd met een orgaandisfunctie. Om te evalueren of het model klinisch relevant zou kunnen zijn, beoordeelden we 24 uur na het protocol plasmatische markers van orgaanletsel. De creatininemie (Sham: 19,13 μmol/L ± 0,33 μmol/L; HS: 28,88 μmol/L ± 2,69 μmol/L), het cardiale troponine T (Sham: 9,38 ng/L ± 1,87 ng/L; HS: 35,62 ng/L ± 2,28 ng/L), en het aspartaat- en alanineaminotransferase (ASAT: Sham: 221 UI/L ± 48 UI/L; HS: 963 UI/L ± 144 UI/L; ALAT: Schijnvertoning: 36 UI/L ± 4 UI/L; HS: 323 UI/L ± 13 UI/L) die respectievelijk schade aan de nier, het hart en de lever weerspiegelen, zijn allemaal significant verhoogd met de hemorragische shock (Figuur 4). Figuur 4: Het hemorragische shockmodel wordt geassocieerd met orgaandisfunctie. (A) Creatininemie, (B) cardiaal troponine T, (C) aspartaataminotransferase en (D) alanineaminotransferasespiegels 24 uur na hemorragische shockinductie tussen schijn- en hemorragische shockdieren. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische significantie werd beoordeeld door middel van een ongepaarde t-toets. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullend bestand 1: Details van de gedragsscore Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In dit artikel hebben we voor het eerst een representatief rattenmodel van hemorragische shock beschreven op basis van een mix tussen de modellen met vaste druk en een vast volume. We hebben aangetoond dat ons model 24 uur na de schokinductie geassocieerd is met een verandering van hemodynamische parameters en metabolisme.

Vanwege de complexe pathofysiologie vereist de studie van hemorragische shock het gebruik van geïntegreerde diermodellen. In vitro benaderingen kunnen inderdaad niet alle routes nabootsen die betrokken zijn bij deze ziekte. Het ontwaken van de dieren na het hemorragische shockprotocol is een stap die zorgt voor een betere replicatie van de klinische situatie. Vanwege de moeilijkheid om de dieren wakker te maken, zijn er maar heel weinig studies die deze fase hebben opgenomen. De zeldzame onderzoeken waarbij dieren wakker worden, offeren ze op korte tijdstippen (2 uur of 6 uur), wat niet volledig weerspiegelt wat er gebeurt voor patiënten 16,18,23,24. Ondanks de ontwikkeling van hemorragische shockmodellen, hebben slechts enkele studies parameters (ontsteking, apoptose, orgaandisfunctie) 24 uur na de schokinductie geëvalueerd, waardoor de moeilijkheid van dit soort protocol wordt benadrukt 25,26,27. De ontwikkeling van computer- en wiskundige modellen heeft een revolutie teweeggebracht in het onderzoek. Er zijn talloze wiskundige modellen van hemorragische shock ontwikkeld, maar de meeste van deze modellen houden geen rekening met het volledige scala aan lichaamsvloeistofuitwisselingen tijdens hemorragische shock en moeten worden verbeterd voordat ze mogelijk klinisch toepasbaar zijn²⁸. Tot op heden is een van de belangrijkste uitdagingen de ontwikkeling van een diermodel dat de pathologie bij de mens zo goed mogelijk nabootst.

In de literatuur wordt een groot aantal hemorragische shockmodellen beschreven die verschillen via vasculaire benaderingen, afgenomen bloedvolumes of de gerichte druk¹³. Meer in het algemeen kunnen de hemorragische shockmodellen worden ingedeeld in 3 groepen: bloeding met een vast volume, bloeding met een vaste druk en ongecontroleerde bloeding. De standaardisatie en reproduceerbaarheid met de bloeding met een vast volume zijn moeilijk en worden verklaard door de verhouding bloedvolume/lichaamsgewicht, die lineair afneemt met het gewicht van de rat. De bloeding met vaste druk wordt veel gebruikt, wat verklaart dat de instellingen (gerichte druk, duur van de schok) zeer variabel zijn van het ene onderzoek naar het andere, waardoor het moeilijk is om de resultaten van het ene model naar het andere te transponeren. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat hemodynamische stoornissen, die een cruciale rol spelen in de pathofysiologie van hemorragische shock, niet systematisch worden beoordeeld, wat de discrepantie in resultaten tussen onderzoeken zou kunnen vergroten. Ten slotte roept het model voor ongecontroleerde bloedingen, hoewel klinisch relevant, vragen op over reproduceerbaarheid en ethiek. Om klinische relevantie, standaardisatie en reproduceerbaarheid zoveel mogelijk met elkaar te verzoenen, hebben we een gemengd model ontwikkeld met zowel fasen met een vast volume als met een vaste druk.

In het hier beschreven model worden de temperatuur en de ademhalingsfrequentie 24 uur na de operatie niet gewijzigd. Dit kan worden verklaard door het feit dat de operatie onder steriele omstandigheden wordt uitgevoerd, waardoor de pro-inflammatoire reactie wordt beperkt. Hemorragische shock wordt gedefinieerd als een acuut falen van de bloedsomloop als gevolg van bloedverlies dat gepaard gaat met een daling van de bloeddruk. Net als bij mensen veroorzaakt dit model van hemorragische shock een afname van de gemiddelde arteriële druk, met name als gevolg van een verlaging van de diastolische bloeddruk. Interessant is, en zoals eerder beschreven, dat de hartslag ongewijzigd is na de reanimatiefase in dit model van hemorragische shock 29,30,31. De daling van de gemiddelde arteriële druk wordt waarschijnlijk geassocieerd met een verminderde orgaanperfusie, wat leidt tot multiviscerale disfunctie, wat kan worden geïllustreerd door de toename van verschillende plasmatische markers in ons model (creatininemie, cardiaal troponine T, ASAT en ALAT). De verstoring van de zuurstoftoevoer leidt tot een anaëroob metabolisme, wat een toename van lactatemie veroorzaakt³². Zoals eerder beschreven, leidt dit model van hemorragische shock tot een verhoging van de bloedlactaatspiegels³⁰. Deze toename kan in verband worden gebracht met de ischemie die wordt veroorzaakt ter hoogte van de dijbeenslagader. Gezien het feit dat de dieren in de schijngroep fysiologische lactatemie hebben en dezelfde chirurgische ingreep hebben ondergaan als de hemorragische shockgroep, lijkt het erop dat deze toename verband houdt met het hemorragische shockprotocol. Al deze gegevens samen bevestigen dat het in deze studie beschreven protocol de ontwikkeling van een nieuw relevant model van hemorragische shock bij de rat mogelijk maakt.

De beperking van dit model is het gebruik van heparine, dat essentieel is om de natuurlijke stolling van bloed te verminderen wanneer het in contact komt met plastic materialen zoals canules. Het gebruik van heparine kan echter invloed hebben op de coagulopathie die gepaard gaat met traumatische hemorragische shock³³. Bij dit onderzoek zijn gezonde mannelijke dieren van 11-13 weken oud betrokken. Aangezien geslacht, leeftijd en comorbiditeiten (hypertensie, diabetes, enz.) de resultaten kunnen beïnvloeden, zou het relevant zijn om hun impact in ons model te evalueren. In het protocol wordt de reanimatiestap uitgevoerd via een injectie met Ringer Lactaat, een kristalloïde die coagulopathie en weefseloedeem kan bevorderen³⁴. Hoewel het gebruik van bloedproducten optimaal is, zijn deze schaars en bederfelijk en kan het moeilijk zijn om voldoende rattenbloed te hebben voor het hele protocol. Bloedproduct en op kristalloïden/colloïden gebaseerde reanimatie hemorragische shockmodellen zijn twee complementaire benaderingen.

De sterke punten van dit model zijn 1) de hoge reproduceerbaarheid (geïllustreerd door de lage variabiliteit in de resultaten), 2) het gebruiksgemak (de meeste instrumenten zijn klassiek en vasculaire benaderingen zijn bekend) en 3) de klinische relevantie, met name vanwege het ontwaken van dieren en multi-viscerale disfunctie. Op basis van de gedragsscore beschreven in Aanvullend Dossier 1 zijn limietpunten vastgesteld. Het offer wordt besproken als een score boven de 9 wordt bereikt, volgens de bijgevoegde tabel. Als een score van 11 wordt bereikt, wordt het dier systematisch geëuthanaseerd. In deze studie bereikte geen van de dieren een score hoger dan 8, en daarom werd geen van de dieren uitgesloten van de studie. Dit kan verklaren waarom het hier beschreven model geassocieerd is met een sterftecijfer dat 3 keer lager is dan dat van de andere 24-uurs studie (16% vs. 47%⁾²⁵.

De kritieke stap van het model is de hemorragische shockfase. Het is belangrijk om het drukbereik van 32-38 mmHg te respecteren. We hebben zelfs waargenomen dat het handhaven van de gemiddelde arteriële druk onder 32 mmHg resulteerde in een snelle en abrupte drukdaling. Omgekeerd levert het handhaven van een druk boven 38 mmHg geen model op dat voldoende dicht bij de klinische realiteit staat. Deze waarnemingen zijn in overeenstemming met het interval van de gemiddelde arteriële druk dat in andere modellen wordt beoogd¹³.

Concluderend hebben we aangetoond dat het hemorragische shockmodel bij ratten dat in deze studie is beschreven, klinisch relevant is en nuttig kan zijn voor zowel het begrijpen van pathofysiologische mechanismen door het identificeren van nieuwe biologische actoren/routes als voor het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën door het testen van verschillende kandidaat-moleculen.

Materials

1 mL syringe	TERUMO	MDSS01SE
2.5 mL syringe	TERUMO	SS*02SE1
20 mL syringe	TERUMO	MDSS20ESE
Anesthesia induction chamber	TEMSEGA	HUBBIV4
BD Microlance 3 23 G needle	Becton Dickinson	300800
BD Microlance 3 26 G needle	Becton Dickinson	304300
Blood pressure transducer	emka TECHNOLOGIES	BP_T
Buprecare	Axience	N/A	1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL
DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps	ALLGAIER instrumente medical	09-543-150
Dermal Betadine 10%	Mylan	N/A	125 mL bottle
Fine Forceps – Curved / Serrated	Fine Science Tools	11065-07
GraphPad Prism 8	GraphPad by Dotmatics	–
Heating mats	TEMSEGA	OPT/THERM_MATELASSTEREORATS
Heparin sodium	PANPHARMA	N/A	5 mL bottle, 5,000 UI/mL
IOX2 software	emka TECHNOLOGIES	IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a
Iris Scissors – ToughCut	Fine Science Tools	14058-11
Lidocaine	Fresenius	N/A	10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride
MiniHub-V3.2	TEMSEGA	PF006
Moria 201/A Vessel Clamp – Straight	Fine Science Tools	18320-11
Non sterile compresses	Raffin	70189
Non sterile drape	Dutscher	30786
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
Polyethylene tubing PE10	PHYMEP	BTPE-10
Polyethylene tubing PE50	PHYMEP	BTPE-50
Rats	Charles Rivers	–	Male WISTAR HAN (10 weeks)
Rectal probe	TEMSEGA	SONDE_TEMP_RATS
Ringer Lactates	Fresenius Kabi	964175
Scrub Betadine 4%	Mylan	N/A	125 mL bottle
Sevoflurane	Abbott	N/A	250 mL bottle, gas 100%
Sevoflurane Vaporizer	TEMSEGA	SEVOTEC3NSELEC
StatStrip lactate test strips	Nova Biomedical	47486
StatStrip Xpress lactate Meter	Nova Biomedical	47486
Sterile compresses	Laboratoire SYLAMED	211S05-50
Sterile drape	Mölnlycke	800330
Steriles gloves	MEDLINE	MSG7275
Suture	Optilene	3097141
Suture for vessels	SMI	8150046
Syringe pump	Vial médical	16010
usbAMP	emka TECHNOLOGIES	–
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Vaseline	Cooper	N/A	10 mL vial
Vitamin A Dulcis (ALLERGAN)	Allergan	N/A	10 g tube, Retinol