CD4 T细胞在复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

摘要

采用小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，从活化阶段及免疫效应功能的角度，研究CD4 T细胞在EAE发病及复发过程中的作用。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）并导致脱髓鞘。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究MS的典型动物模型。在本研究中，我们旨在探讨CD4 T细胞在EAE发病和复发过程中的作用，重点关注其激活阶段及免疫应答。为建立EAE小鼠模型，采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55肽段与完全弗氏佐剂（CFA）乳化后对雌性小鼠进行免疫。每日评估临床评分，结果显示EAE组小鼠表现出典型的复发-缓解模式。苏木精-伊红（H&E）染色和Luxol快蓝（LFB）染色分析显示，EAE小鼠中枢神经系统存在显著的炎性细胞浸润和脱髓鞘现象。在激活阶段，CD4⁺CD69⁺效应T（Teff）细胞和CD4⁺CD44⁺CD62L^-效应记忆T（Tem）细胞均可能参与EAE的启动 ，但复发阶段可能主要由CD4⁺CD44⁺CD62L^- Tem细胞主导。此外，在免疫功能方面，辅助性T（Th）1细胞主要参与EAE的启动过程，而Th1和Th17细胞均参与复发阶段，且在EAE病理过程中，调节性T（Treg）细胞的免疫抑制功能受到抑制。

引言

多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）并导致脱髓鞘^1,2。最近的一项研究表明，它是影响青年人群的最常见致残性疾病，且其发病率在全球范围内持续上升³。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的典型动物模型，可模拟人类MS炎症阶段的多个方面⁴。从免疫功能的角度来看，尚未接触过抗原的初始CD4 T细胞被称为辅助性T（Th）0细胞。这些细胞经过成熟和活化过程后表现出多种功能。根据其特定功能，CD4 T细胞可分为多个亚群，包括Th1、Th2、调节性T（Treg）、滤泡辅助性T（Tfh）、Th17、Th9和Th22细胞⁵。普遍认为，Th1和Th17细胞亚型是EAE发病机制中的关键因素⁶。Th1细胞可分泌干扰素γ（IFN-γ），而Th17细胞则分泌白细胞介素（IL）-17及其他炎症因子，这些因子能够激活小胶质细胞和星形胶质细胞等其他免疫细胞。这些细胞产生如IL-18、IL-12、IL-23和IL-1β等炎症性细胞因子⁷，可进一步诱导Th1/Th17细胞的免疫应答，导致进行性脱髓鞘和轴突损伤。从活化阶段的角度来看，CD4 T细胞具有预先决定的命运，可....

方案

本研究共使用18只6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，随机分为对照组（n = 6）和EAE组（n = 12）。小鼠购自宁夏医科大学实验动物中心。小鼠饲养于温湿度可控、12小时光照/黑暗循环的环境中，并可自由获取新鲜水和食物。研究开始前，已获得宁夏医科大学实验动物伦理委员会的伦理批准。

1. C57BL/6 小鼠中复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎的建立

1. 试剂溶解
   1. 将 5.4 mg MOG35-55（材料表）溶解于 1.8 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中。称取 12.6 mg 结核分枝杆菌 H37RA（材料表），加入 1.8 mL 完全弗氏佐剂（CFA）溶液（材料表）中。使用移液器（材料表）将 360 µL 百日咳毒素（PTX；材料表）溶解于 7.2 mL PBS 中。
2. MOG35-55 与 CFA 乳剂的制备
   1. 使用步骤 1.1 中准备的两个 5 mL 注射器分别吸取 MOG35-55 溶液和 CFA 溶液，并通过三通阀连接。在冰上持续混合 1 小时，直至形成乳白色的油包水乳剂。
      注意：当乳剂滴入水中后漂浮于水面且不扩散时，表明乳剂已成功....

结果

临床评分评估
如图1所示，对照组小鼠未表现出任何临床症状。用MOG35-55免疫的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）组小鼠在免疫后约12天出现尾部麻痹。至第16天，症状发展为完全性后肢瘫痪（定义为高峰期，Peak）。此后，症状逐渐缓解。小鼠的临床症状在约第25天再次加重，并于第30天左右再次达到完全性后肢瘫痪（定义为复发期，RR）。值得注意的是，此次症状持续时间较前次更长，呈现出典型的复发-缓解特征。复发-缓解型EAE小鼠在疾病进展过程中会经历发作、缓解和复发等不同阶段，具有一定的周期性和波动性。

组织学分析
对照组小鼠脑组织结构完整，血管分布均匀，界限清晰，无炎性细胞浸润。（图2A）。EAE组小鼠在疾病高峰期，脑组织中可见大量炎性细胞浸润（图2B），在血管周围形成袖套样改变（红色箭头指示）。同样，在EAE组小鼠的复发缓解.......

讨论

多发性硬化症（MS）是中枢神经系统最常见的自身免疫性脱髓鞘疾病，全球有数百万人受其影响¹⁷。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是模拟MS临床病理特征的典型动物模型¹⁸。研究表明，MS患者由于中枢神经系统内轴突和神经元的退化，会出现认知功能障碍及其他残疾^19,20,21。在EAE模型的高峰期和复发-缓解（RR）阶段，小鼠表现出尾部及后肢瘫痪。此外，观察到炎性细胞浸润中枢神经系统，导致不同程度的髓鞘丢失。这些结果表明本实验中EAE模型建立成功。

MOG35-55 与 CFA 的乳化过程需在冰上进行，以防止匀质过程中因产热导致 MOG35-55 降解。百日咳毒素（PTX）通过腹腔注射给予，以增强血管通透性，使 T 细胞更易穿过血脑屏障并到达神经元周围的髓鞘²²。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉机蒸发器	诺瓦普	20-17368
异氟烷	Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司	792632
70 μm细胞滤筛	XIYAN Co., Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD45 抗体	Biolegend	103128
APC 抗小鼠 CD4 抗体	Biolegend	100616
自动细胞计数器	江苏集慕生物科技有限公司	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) 小鼠 Th1/Th2/Th17 CBA 试剂盒	BD 生物科学	560485
生物素标记的抗小鼠 CD16/32 抗体	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD69 抗体	Biolegend	104532
BV786 大鼠抗小鼠 CD62L（MEL-14）	BD Pharmingen	563109
柱状组织&Cell 蛋白提取试剂盒	上海酶工程生物医药科技有限公司	PC201Plus
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司	SLCH4887
脱水机	DIAPATH	Donatello
一次性无菌注射器（1 mL）	Yikang Group	210820
一次性无菌注射器（2.5 mL）	Yikang Group	210820
一次性无菌注射器（5 mL）	Yikang Group	210820
染色机	DIAPATH	Giotto
包埋机	武汉俊杰电子有限公司	JB-P5
乙醇	干细胞研究中心	100092683
胎牛血清	普罗赛尔生命科学&科技有限公司	FSP500
FITC 豚鼠抗小鼠 CD3e (145-2C11)	BD Pharmingen	553062
流式细胞仪	Becton, Dickinson and Company	FACSCelesta
流式细胞仪	Becton, Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo 软件	BD 生物科学	10.8.1
冷冻平台	武汉俊杰电子有限公司	JB-L5
载玻片	Servicebio	G6004
HE染色液套装	Servicebio	G1003
苏木精-伊红溶液	Servicebio	G1002
高速冷冻离心机	赛默飞世尔科技	Mogafugo8R
成像系统	尼康	尼康 DS-U3
Luxol快蓝染色试剂盒	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
结核分枝杆菌 H37RA	BD Pharmingen	231141
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）	AnaSpec	AS-60130-1
中性树胶	干细胞研究中心	10004160
组织者	KEDEE	KD-P
烘箱	实验室	GFL-230
病理切片机	Leica	RM2016
百日咳博德特菌来源的百日咳毒素	Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司	P7208
磷酸盐缓冲液	Servicebio	G4202
移液0.5-10 μL	DLAB Scientific	7010101004
移液器 100-1000 μL	DLAB Scientific	7010101014
移液器 20-200 μL	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	普罗赛尔生命科学&有限公司	PM150110
三通阀	广东康华医疗有限公司	A06
组织牵开器	浙江科华仪器有限公司	KD-P
直立式光学显微镜	尼康	尼康 ECLIPSE E100
二甲苯	干细胞研究中心	10023418