结合液相色谱-高分辨质谱法的13C6-葡萄糖标记方法具有广泛适用性，为今后研究药用植物中次生代谢物合成所涉及的主要器官和代谢途径，以及次生代谢物的综合利用奠定了基础。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种用于鉴定参与次生代谢物合成的主要器官的新型高效方法。作为最重要的次生代谢物之一， 重楼 变种 yunnanensis (Franch.) Hand.-Mzt. (PPY)， 巴黎 皂苷（PS）具有多种药理活性，而原人参二醇（PPY）的需求日益增长。本研究建立了叶、根茎和茎维管束 13C6- 葡萄糖喂养与非喂养的四种处理，以精确定证所涉及的主要器官 巴黎 皂苷VII（PS VII）的合成。通过结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）， 13C/12叶片、根茎、茎和根在不同处理下的C比率被快速且准确地计算，并获得了四种PS同位素离子峰（M−）比值如下：（M+1） −/−，（M+2） −/−，（M+3） −/− 和（M+4） −/−结果显示，该比例 13C/12茎维管束和根茎取食处理中根茎的碳含量显著高于非取食处理。与非取食处理相比，PS VII分子（M+2）的比例 −/− 在叶片和茎维管束饲喂处理下，叶片中的含量显著增加。同时，与不饲喂处理相比，PS VII分子（M+2）的比例 −/− 在根茎处理下的叶片中未表现出显著差异。此外，PS VII分子（M+2）的比值 −/− 在茎、根和根茎中，四种处理之间的差异不显著。与非取食处理相比，其比值 巴黎 皂苷II（PS II）分子（M+2） −/− 在叶片取食处理下的叶片中未表现出显著差异，且（M+3） −/− 在叶片饲喂处理下，叶片中PS II分子的比例较低。该数据证实，合成PS VII的主要器官是叶片。这为今后鉴定药用植物中次生代谢物合成的主要器官及相关途径奠定了基础。
引言
植物次生代谢物的生物合成途径复杂多样，涉及高度特异且多样的积累器官1。目前，许多药用植物中次生代谢物的具体合成位点及其负责器官尚不明确。这种不确定性对旨在优化药材产量和质量的栽培技术的战略发展与实施构成了重大障碍。
分子生物学、生物化学和同位素标记技术被广泛用于解析药用植物中次生代谢物的合成途径及其合成位点2,3,4,5，这些方法各自具有独特的优点和局限性，例如在效率和准确性方面存在差异。分子生物学方法在精确定位生物合成途径中的位点方面具有高精度，但耗时较长。此外，对于缺乏公开可用基因组序列的物种，这些方法的应用受到限制，因而在此类情况下可行性较低6。相比之下，同位素标记技术利用3C/12C、2H/1H和18O/16O等同位素比值，为研究次生代谢物的合成、转运和储存机制提供了快速且可行的手段7,....
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方案
1. 实验准备
- 确保植物生长期间，温室相对湿度为75%，昼夜温度为20 °C/10 °C，光周期为12小时光照和12小时黑暗，光照强度为100 µmol·m⁻²·s⁻¹。-2·s-1通过发光二极管（LED）灯提供辐照度，保持LED灯与植物冠层之间30 cm的距离。
注意：光周期和光照强度根据云南生长季节的日照时数确定。光照强度通常使用量子传感器进行测量（参见 材料表）。根据药用植物的特性调整必要的环境参数。一旦依据植物特性和当地日照情况对这些环境条件进行了精确校准，就必须在整个实验过程中保持这些设置的一致性。在初始设定完成后，随意更改环境参数可能会影响实验的完整性及结果的可靠性。 - 采用水培方法18 为确保实验的准确性和特异性，将采自云南省文山（104°11′E，23°04′N）的经洗涤的2年生PPY幼苗浸入 1/4 使用霍格兰营养液标准浓度培养 3 天以进行适应。
- 制备霍格兰营养液（参见 材料表) 溶液，按照说明书操作；将1.26 g Hoagland粉末和0.945 g硝酸钙粉末加入4 L纯化水中。制备 13C6-葡萄糖（参见 材料表）溶....
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结果
为了确认13C6-葡萄糖在根状茎中的供给成功，我们进一步分析了根状茎中13C/12C同位素比值。处理组3和处理组4的13C/12C同位素比值明显高于处理组2（图1A）。结果表明，来自处理组3和处理组4的13C6-葡萄糖通过摄食进入了根状茎。
13C同位素峰的比值，例如(M+1)−/M−、(M+2)−/M−、(M+3)−/M−和(M+4)−/M−，通常保持恒定。使用外源添加的13C标记的化合物与其未标记的对应物具有相同的分子结构、相似的分子量、理化性质以及保留时间。然而，当这些标记化合物通过质谱分析时，其同位素离子峰的比值会发生变化。在.......
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讨论
成功实施本方案的关键在于对植物生理特性、组织、器官及次生代谢产物进行系统深入的研究。本方案中所述的实验设计方法为探究植物次生代谢产物的生物合成途径奠定了坚实基础。本实验的关键因素包括：（1）确定多年生幼苗的生长年限；（2）选择合适的同位素标记与检测时机。药用植物可分为多年生和一年生两类，其次生代谢产物的合成与积累模式各不相同。本实验旨在通过分析这些代谢产物的合成速率，明确药用植物中次生代谢产物的主要合成器官。因此，必须谨慎选择与这些合成模式和速率相对应的生长年份和发育阶段。
PPY 是一种多年生药用植物，其PS含量逐年积累。然而，研究表明，PPY的PS合成速率与其它多年生植物相比并无差异22。同时，2年生幼苗相较于更年长的植株体型较小，便于进行水培实验。因此，本研究采用2年生PPY幼苗，以确保所选植株具有最高的次生代谢物合成速率。必须认识到，不同物种之间次生代谢物的合成与转运速率存在差异23，而标记-检测周期的最佳时长正是由这些速率决定的。研究显示，PPY叶片中糖类和PS的含量在3天内即.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由国家自然科学基金青年项目（编号：82304670）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 % 甲酸水溶液 | 成都科龙化学试剂厂 | 44890 | |
| 13C6-葡萄糖粉末 | MERCK | 110187-42-3 | |
| 乙腈 | 成都科龙化学试剂厂 | 44890 | |
| 自动进样瓶 | 碧云天生物技术有限公司 | 44866 | |
| BEH C18 色谱柱 | Waters, Milfor, MA | 1.7μm, 2.1*100 mm | |
| CNC 超声波清洗机 | 昆山超声仪器有限公司 | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM 软件 | Thermo Scientific, Fremont, CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM 软件 | Thermo Scientific, Fremont, CA | 3 | |
| 电热恒温鼓风干燥箱 | DHG-9146A | ||
| 电子分析天平 | 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 | SOP | |
| 乙醇 | 成都科龙化学试剂厂 | 44955 | |
| 全自动样品快速研磨仪 | 上海净信科技 | Tissuelyser-48 | |
| 气相色谱-稳定同位素比质谱仪 | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| 霍格兰营养液 | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| 水培槽 | JRD | 1020421 | |
| Isodat 软件 | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| 液相色谱-高分辨质谱联用仪 | Agilent Technology | Agilent 1260 -6120 | |
| 氮气发生仪 | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| 有机相滤膜 | 天津津腾实验设备有限公司 | 44890 | |
| 氧气泵 | 魔力龙 | MFL | |
| 量子传感器 | Highpoint | UPRtek | |
| 手术刀 | Handskit | 11-23 | |
| 喷壶 | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur 软件 | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
参考文献
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H.
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重印与许可
