腹腔内给药是一种安全有效的非侵入性方法，可用于诱导胰腺损伤。本研究比较了五种不同的小鼠腹腔注射方案，以诱导不同程度的胰腺损伤，并建立重度胰腺损伤模型，用于探讨重症急性胰腺炎（SAP）的病理变化及治疗策略。
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方法文章
通过雨蛙素与脂多糖腹腔注射联合制备小鼠重症急性胰腺炎模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
重症急性胰腺炎（SAP）死亡率较高，其治疗面临重大临床挑战。利用动物模型研究SAP相关的病理变化，有助于发现潜在的治疗靶点并探索新的治疗方法。以往的研究主要通过逆行胆管注射牛磺胆酸钠诱导胰腺损伤，但手术操作本身对动物模型质量的影响尚不明确。本研究采用不同频率的腹腔注射雨蛙素（Caerulein）联合不同剂量的脂多糖（LPS）在C57BL/6J小鼠中诱导胰腺损伤，并比较了五种腹腔注射方案下损伤程度的差异。针对小鼠急性胰腺炎的建模，本文提出一种可在5天内导致高达80%死亡率的腹腔注射方案：小鼠每日接受10次腹腔注射雨蛙素（50 µg/kg），末次注射雨蛙素后1小时再给予LPS（15 mg/kg）注射。通过调节药物注射的频率和剂量，可有效调控胰腺损伤的严重程度。该模型具有良好的可控性，复制周期短，可由单名研究人员独立完成，无需昂贵设备。该方法能够便捷、准确地模拟人类SAP的关键疾病特征，且具有高度可重复性。
引言
重症急性胰腺炎具有起病急骤、进展迅速和在消化系统疾病中病死率高的特点1。其高死亡率一直是临床研究的重点。由于临床病情变化难以预测、疾病表现异质性强以及人体标本获取有限，建立动物模型在疾病研究中变得愈发重要。
将牛磺胆酸钠逆行注入胆总管是建立大鼠重症急性胰腺炎（SAP）模型的常用方法2。该建模技术通过模拟胰胆管梗阻并诱导胆汁与胰液反流，能够高效复制SAP动物模型。然而需注意，侵入性手术本身会对动物模型产生一定影响。此外，该方法仅适用于大鼠和犬等体型较大的实验动物。其他常用的建模技术还包括十二指肠插管法3、直接十二指肠穿刺法4以及胆总管-胰管直接穿刺法5。
腹腔注射和饮食诱导建模方法具有非侵入性优势，可适用于任何体型的动物。通过喂食胆碱缺乏-乙硫氨酸（CDE）诱导的重症急性胰腺炎小鼠模型6 会引发一些并发症，例如难以控制的高血糖和低钙血症，因此不适合用于评估新的诊断和治疗方法。另一方面，腹腔注射Caerulein联合L-arginine7 是目前在小鼠中诱导急性胰腺炎最常用的方法。具体而言，重复....
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方案
本方案经安徽科技大学第一附属医院（中国淮南）伦理委员会审核批准（伦理编号：2023-KY-905-001）。研究遵循公共卫生服务政策或《实验动物照护与使用指南》中关于实验动物操作的规定。本研究采用6至8周龄、体重20–30 g的雄性C57BL/6J成年小鼠。小鼠在受控条件下（温度约21 °C，12小时昼夜循环）的动物实验室中饲养一周。实验期间小鼠可自由摄食和饮水。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.
1. 动物准备
- 将84只健康的C57BL/6J小鼠分为六组，包括对照组、胰腺损伤（PI）I、PI II、PI III、PI IV和PI V组。
- 在开始建模程序之前，用耳缘缺口标记每组小鼠，并使其禁食12小时。
2. 诱导药物稀释液的制备
- 将胆囊收缩素（Caerulein，1 mg）溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并于 -20 °C 冷冻保存。
- 在对实验小鼠进行腹腔注射药物前 1 小时，测量并记录其体重。
- 根据所有小鼠的总重量，按 50 µg/kg 的比例计算并提取所需胆囊收缩素（Caerulein）的总质量。
- 再次用 PBS 稀释所获得的胆囊收缩素（Caerule....
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结果
实验小鼠模型构建过程如图所示 图1注射完成后12小时，使用旷场视频记录仪监测各实验组小鼠在5个周期内的移动距离和静止持续时间。图2A）。在5个循环期间，PI V组小鼠在3分钟内的运动距离保持在较低水平，而3分钟内的不动比例在后续每个循环中逐渐增加（图2B，C）。此外，对不同实验组小鼠在5个周期内的总移动距离进行了统计学分析。PI V组的总移动距离最小，与其他实验组相比差异具有统计学意义（p < 0.001) (图 2D，E）。除对照组和PI I组外，其他实验组小鼠的D值体重均呈现负增长。其中，PI V组的体重变化最为显著，与其他实验组相比，其体重变化差异具有统计学意义（图2F）。在额外评估了每组10只小鼠的存活率后，结.......
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讨论
目前，尚缺乏有效手段来改善重症急性胰腺炎患者的高死亡率问题。研究药物在增强免疫稳定机制方面的有效性至关重要。建立理想的重症急性胰腺炎动物模型迫在眉睫。C57BL/6J遗传背景的小鼠广泛应用于生物医学研究，包括重症急性胰腺炎（SAP）病理生理学的研究。由于B6J小鼠经历了超过70年的遗传分化，导致多个外显子发生自发性缺失15，从而降低了对蓝斑素（Caerulein）诱导的胰腺损伤的敏感性16。此外，现有的急性胰腺炎动物模型存在诸如手术创伤或仅适用于较大动物等局限性，限制了这些模型在科学研究中的应用。因此，利用这一特定基因品系建立稳定、高效且便捷的动物模型具有重要价值。
胆囊收缩素类似物Caerulein通过在小鼠禁食并积聚足够量消化液后短时间内高频注射，导致胰腺消化液和酶分泌发生相对性阻塞，从而诱发胰腺组织损伤17脂多糖（LPS）是细菌细胞壁中的主要成分，可在小鼠中引发多器官功能障碍综合征（MODS）和全身性炎症反应综合征（SIRS）。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由淮南市卫生健康与医学科学研究项目（编号：HNWJ2023005）；淮南市市级引导科技计划项目（编号：2023151）；安徽省大学生创新创业训练计划项目（编号：S202310361254）；第九批 "50·科技之星" 淮南市创新团队及安徽省重点临床专科建设项目。我们谨向安徽理工大学第一附属医院检验科致以诚挚感谢，感谢其提供相关检测数据。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20× 柠檬酸抗原修复液（pH 6.0） | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | G1202-250 ml | |
| 淀粉酶 | 迈瑞，中国 | ||
| Annexin V-FITC/PI | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1511 | 1:20 稀释 |
| 兔源抗HMGB1多克隆抗体 | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | GB11103 | 1:1800 稀释 |
| BCA蛋白定量检测试剂盒 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II 流式细胞仪 | BD生命科学公司，美国加利福尼亚州圣何塞市，邮编95131 | BD FACSCanto II | |
| BSA | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | 中国常州 Cavion 实验动物有限公司 | 许可证编号 SCXY (苏) 2011–0003 | |
| Ceruletide | 美国新泽西州 MCE | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| 化学发光成像仪 | Cytiva 公司；美国 | ||
| 柠檬酸抗原修复液（干粉，pH 6.0） | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1201-5 L | |
| 胶原酶IV | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB（SA-HRP）Tunel细胞凋亡检测试剂盒 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1507-100 T | |
| Dimension EXL 配备 LM 一体化化学分析系统 | 西门子医疗诊断公司，美国布鲁克菲尔德 | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL 显影液 | 中国武汉，Servicebio 技术有限公司 | ||
| 伊红染料（醇溶性） | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus，荷兰 | ||
| FITC标记的山羊抗兔IgG | 中国武汉服务生物技术有限公司 | GB22303 | 1:50 稀释 |
| 全自动血细胞分析仪 | Zybio公司 中国 | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | 中国武汉服务生物技术有限公司 | GB11103 | 1:1500 稀释 |
| 苏木精返蓝液 | 中国武汉，Servicebio 技术有限公司 | G1040-500 ml | |
| 苏木精分化液 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1039-500 ml | |
| 苏木精染料 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA试剂盒 | 中国nj jc生物有限公司 | ||
| 匀浆器 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | KZ-III-F；IC111150 100222 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | 中国武汉服务生物技术有限公司 | GB23303 | 1:1500 稀释 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | GEM0001 | |
| 脂肪酶 | 迈瑞，中国 | ||
| 脂多糖 | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | GC205009 | 15 mg/kg |
| 低温高速离心机 | 长沙平凡仪器&安普&仪器有限公司，中国 | TGL-20M | |
| 膜破裂液 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1204 | |
| 切片机 | 中国杭州金华东创仪器有限公司 | CR-601ST | |
| 尼龙网 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | 200目 | |
| 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（DAB染色法） | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G1507-100T | |
| 石蜡组织包埋机 | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD；中国江苏常州 | PBM-A | |
| 病理组织干燥装置 | PRECISION MEDICINE INSTRUMENTS CO.,LTD；中国常州 | PHY-III | |
| 磷酸盐缓冲液 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G4202-100ML | |
| PMSF | 中国武汉服务生物技术有限公司 | G2008-1 ml | |
| 正荧光显微镜 | 奥林巴斯株式会社，日本东京 | BX53 | |
| 降钙素原 | 迈瑞，中国 | ||
| PVDF膜 | 美国默克密理博公司 | 0.22 µm | |
| RIPA | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | 碧云天生物技术，中国 | P0012A | |
| TNF-ααELISA试剂盒 | 中国武汉服务生物技术有限公司 | GEM0004 | |
| 超声波水浴 | 中国东莞科桥超声波设备有限公司；中国 | KQ-200KDE | |
| 蛋白质印迹法 | Bio-Rad Laboratories, Inc., 美国 | ||
| Western blot 成像系统 | 全球生命科学知识产权控股有限责任公司，日本 | Amersham ImageQuant 800 | |
| 漩涡混合器 | SCILOGEX；美国 |
参考文献
- Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
- Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis thr....
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重印与许可
