使用ELISA法检测MCF-7细胞中8-oxo-dG水平以评估氧化性DNA损伤

摘要

本方案描述了一种利用ELISA技术对MCF-7细胞中DNA氧化损伤进行定量检测的有效方法。

摘要

8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）碱基是常见的DNA氧化损伤中最主要的形式。DNA损伤显著影响基因表达，并在促进神经退行性疾病、癌症和衰老过程中起关键作用。因此，对8-oxo-dG进行精确定量在DNA损伤检测方法的研究中具有重要的临床意义。然而，目前现有的8-oxo-dG检测方法在便捷性、快速性、经济性和灵敏度方面仍存在挑战。本研究采用夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA），一种高效且快速的比色方法，检测经不同浓度过氧化氢（H₂O₂）刺激的MCF-7细胞样品中8-oxo-dG含量的变化₂O₂）。我们测定了H的浓度₂O₂ 通过检测其IC值，诱导MCF-7细胞的氧化损伤₅₀ MCF-7 细胞中的数值。随后，我们用 0、0.25 和 0.75 mM H 处理 MCF-7 细胞₂O₂ 孵育12小时后，从细胞中提取8-oxo-dG。最后，对样品进行ELISA检测。经过一系列步骤，包括包板、洗涤、孵育、显色、终止反应和数据采集，我们成功检测到H诱导的MCF-7细胞中8-oxo-dG含量的变化₂O₂通过这些努力，我们旨在建立一种评估细胞样本中DNA氧化损伤程度的方法，从而推动更快速、便捷的DNA损伤检测技术的发展。该研究将为探索DNA氧化损伤与多个领域之间的关联分析作出有意义的贡献，包括疾病临床研究以及有毒物质检测。

引言

DNA 氧化损伤是活性氧（ROS）的生成与细胞抗氧化防御系统之间失衡的结果¹。其主要涉及 DNA 嘌呤和嘧啶碱基的氧化^2,3。DNA 碱基的这种氧化修饰不仅破坏基因组的完整性，还与多种病理问题相关，包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病^4,5。DNA 中的鸟嘌呤碱基具有最低的还原电位，最易发生氧化⁶。因此，8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）是评估 DNA 氧化损伤程度的主要标志物^7,8。准确量化 8-oxo-dG 已成为研究疾病发生、发展以及评估多因素氧化负荷的关键问题⁹。

检测8-oxo-dG的传统方法，如高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）、质谱法及相关联用技术，具有高灵敏度和高特异性^10,11,

方案

1. 在 MCF-7 细胞中构建 H₂O₂ 诱导的 DNA 氧化损伤模型

1. MCF-7 细胞复苏
   1. 将含有 3.5 x 10⁶ 个细胞的细胞培养冻存管⁶ MCF-7 细胞储存于 -80°C 冰箱中，并迅速转移至含有液氮的泡沫盒内。用镊子取出冻存管，置于 37 °C 恒温水浴中约 1 分钟，以融化保存的细胞。
      注意：在水浴解冻过程中，需间歇性摇动细胞，以确保冻存管受热均匀。
   2. 将冻存管放入离心机中，在室温下以150 x g离心 g 5 分钟。
   3. 使用移液器弃去冻存管中的上清液，加入1 mL完全培养基。充分混匀后转移至10 mm培养皿中，并补充额外的7 mL完全培养基。
   4. 以十字交叉方式轻轻摇动培养皿以确保混合均匀，并在 CO₂ 培养箱中继续培养。₂ 37 °C、5% CO₂ 培养箱₂.
      注意：完全培养基由添加了10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基组成。
2. 细胞活力评估
   1. 选择处于对数生长期且细胞状态良好的MCF-7细胞用于实验。在对数生长期，细胞通常具有较短的分裂周期和较高的分裂频率。
      1. 使用电子显微....

结果

如图3所示，X轴表示施加于MCF-7细胞的H₂O₂浓度，Y轴表示细胞活力。以0.75 mM浓度处理12小时后，MCF-7细胞的活力降至67%。随着浓度增加，MCF-7细胞活力显著下降，尤其在1.5 mM浓度时，细胞活力降至3%以下（表1）。实验结果表明，MCF-7细胞的IC₅₀为0.7655 mM。

在本系列实验中，我们采用了一种改进的ELISA技术来定量检测8-oxo-dG水平。通过数据分析，得到标准曲线的回归方程为：

Y = 23.66 × X + 0.07038。

如图4A所示，标准曲线表现出良好的线性关系（R²=0.978）；图4B显示，样品中测得的8-oxo-dG浓度与其添加量之间具有高.......

讨论

ELISA 方法的开发对于现有及新型 DNA 损伤检测技术具有重要意义。与传统的高效液相色谱法（HPLC）和质谱技术相比，该方法不仅操作简便，而且具有高灵敏度，能够满足高通量筛选的需求³⁰。这使得在大规模疾病筛查研究中对 8-oxo-dG 进行监测成为可能，有助于深入理解该生物标志物与多种疾病之间的关联。

在实验过程中，若干关键步骤对于确保结果的可靠性和可重复性至关重要。首先，实验准确评估了MCF-7细胞对H₂O₂的敏感性，在12小时时的IC₅₀值为0.7655 mM，反映了MCF-7细胞的耐受水平。该结果对于理解MCF-7细胞的抗氧化防御机制及其在氧化应激条件下的存活具有重要的科学意义，同时为未来抗氧化药物的筛选或相关治疗机制的研究提供了重要的参考指标³¹。此外，8-oxo-dG抗体的选择与配对对于ELISA检测至关重要，直接影响ELISA检测系统的特异性和灵敏度。同时，优化信号放大策略和样品处理步骤也是影响检测准确性的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
细胞计数板	QiuJing	XB-K-25
CO2 培养箱	Thermo	51032872
DMEM 基础培养基(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		统计分析软件
高速离心机	Thermo	9AQ2861
人8-oxo-dG ELISA试剂盒	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ 移液器	Rainin	17014382
L-20XLS+ 移液器	Rainin	17014392
液氮罐	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 细胞	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC 微孔板分光光度计	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
青霉素-链霉素溶液，100X	Beyotime	C0222
三目活细胞显微镜	Motic	1.1001E+12
超低温冰箱	Haire	V118574