本实验方案描述了利用微电极对人组织来源的胃类器官进行pH值测量，以实现对管腔内生理活动的时空表征。
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摘要
摘要
胃肠道类器官模型的优化与详细表征需要先进的方法来分析其管腔环境。本文介绍了一种高度可重复的方法，通过由显微操作器控制的微电极精确测量三维人胃类器官管腔内的pH值。pH微电极为市售产品，由直径为25 µm的斜面玻璃尖端构成。在测量过程中，将pH微电极插入悬浮于Matrigel中的类器官（>200 µm）管腔内，同时将参比电极浸没在培养板的周围培养基中。
利用此类微电极对源自人胃体的类器官进行检测，我们证明了每个培养孔内腔 pH 值相对稳定，约为 7.7 ± 0.037，并且可连续获取至少 15 分钟的测量数据。在一些较大的类器官中，测量结果显示上皮表面与腔内之间存在 pH 梯度，表明类器官中的 pH 测量可实现较高的空间分辨率。在之前的一项研究中，微电极已成功用于测量类器官腔内的氧浓度，显示出该方法在类器官分析中的广泛适用性。综上所述，本方案描述了一种用于功能表征三维类器官内部复杂腔室空间的重要工具。
引言
类器官——源自干细胞的微型多细胞结构——彻底改变了我们研究人类生理学的能力，并开始在监管环境中取代动物模型1。自Sato等人于2009年首次描述肠道类器官以来，类器官技术已变得极为流行2。大量研究已对类器官模型的细胞组成和功能进行了详尽表征3,4,5,6。然而，这些三维多细胞结构的管腔空间在很大程度上仍不明确7,8。管腔是指来源于黏膜组织的类器官中央腔隙，由极化上皮细胞的顶端部分所包围。由于细胞分泌和吸收主要发生在上皮细胞的顶端表面，类器官的管腔微环境正受到这些重要生理过程的调控。目前使用的类器官模型在细胞信号传导模式、整体干性、代谢物浓度梯度以及环境条件方面均表现出差异9。因此，理解类器官管腔的生理特性对于准确模拟器官功能和病理状态至关重要。然而，管腔相对难以接近，这严重阻碍了对三维类器官管腔生理功能的分析10。
研....
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方案
本方案需要直径至少为 200 µm、具有明显管腔且包埋于人工细胞外基质（ECM，例如 Matrigel）中的三维类器官。用于类器官建立的人胃组织经蒙大拿州立大学机构审查委员会批准获取，并获得在博兹曼医疗中心接受上消化道内镜检查患者的知情同意（方案编号 #2023-48-FCR，负责人：D.B.），或来自国家疾病研究互换组织提供的豁免全胃或袖状胃切除标本（方案编号 #DB062615-EX）。本研究中所用类器官品系及传代次数的信息见表 1，培养基成分列于表 2。有关胃肠道类器官品系的建立与维持方法，请参考已发表的方案6,26,27。
1. 人胃类器官用于pH分析的制备
- 使用标准方案启动并维持胃类器官培养。将类器官培养于24孔板中，每孔加入500 µL扩增培养基（表2）。每5–7天传代一次已建立的类器官系，并转移至35 mm玻璃底培养皿中，为pH分析实验做准备。
注意：本实验所用类器官培养物来源于胃腺组织制备物，该组织来源于成体组织，具体方法如上所述。我们采用胶原酶消化法分离这些胃腺，然后将其悬浮于细胞外基质（ECM）中，方....
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结果
分泌酸是人类胃部的一项关键功能。然而，类器官在多大程度上能够模拟酸分泌仍存在争议6,32,33,34。因此，我们开发了上述详细方案，以精确测量胃类器官中的酸生成。值得注意的是，我们使用的是在标准扩增条件下培养、经过多次传代的未刺激成体干细胞来源的类器官，这种处理会导致壁细胞的丢失35。因此，在我们的模型系统中，并不预期存在能够分泌酸的壁细胞或发生主动的酸释放。
在实验中，我们使用了直径介于 200 µm 至 1,000 µm 之间、接种于玻璃底培养皿中的类器官。首先，我们测试了两种不同尖端尺寸的微电极：一种是尖端直径为 25 µm 的 pH-25 电极，另一种是尖端直径为 50 µm 的 pH-50 电极。如图 2A所示，.......
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讨论
类器官腔隙空间的有限可及性严重限制了我们对这一微环境生理动态的理解。一种用于腔内生理功能分析的可靠工具将拓展我们利用类器官的能力 体外 用于生理学、药理学和疾病研究的模型。类器官是高度可调控且具有生理相关性的模型，还具备模拟人类群体遗传变异性的潜力。目前用于测量类器官腔内 pH 值的方法主要采用 pH 敏感性染料或纳米颗粒，这些方法通常需结合荧光显微镜或光谱学技术。16,17,37所述基于微传感器的剖面分析方法为测量胃肠道类器官管腔内pH提供了具有更高空间精度的新途径。本方法可稳定、可靠地测定胃肠道类器官管腔的pH值，并提供了存在pH梯度的证据。在尚未发表的实验中，我们证实了 SLC 家族基因 SLC4A2 和 26A7 已知负责碳酸氢盐分泌以及 SLC9A3, 9A4，以及 9A8 负责质子交换的补充图 S1<.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Ellen Lauchnor 博士、Phil Stewart 博士和 Bengisu Kilic 在 O2 微传感器方面的前期工作与协助；感谢 Andy Sebrell 在类器官培养和显微操作方面的培训；感谢 Lexi Burcham 在类器官培养、培养基制备、数据记录与整理方面的协助；以及感谢 Susy Kohout 博士在电生理学方面的总体建议。我们感谢 Heidi Smith 博士在成像方面的协助，并致谢蒙大拿州立大学生物膜工程中心生物成像平台，该平台获得了美国国家科学基金会 MRI 项目（2018562）、M.J. Murdock 慈善信托基金（202016116）、美国国防部（77369LSRIP & W911NF1910288）以及蒙大拿纳米技术平台（作为 NNCI 成员，获 NSF 资助号 ECCS-2025391）的资金支持。
特别感谢整个Unisense团队为本研究工作提供的支持，尤其感谢Andrew Cerskus博士、Laura Woods博士、Lars Larsen博士、Tage Dalsgaard博士、Line Daugaard博士、Karen Maegaard博士以及Mette Gammelgaard。本研究的资金由美国国立卫生研究院资助项目R01 GM13140801（D.B.，R.B.）和UL1 TR002319（K.N.L.）以及蒙大拿州立大学研究与经济发展办公室的研究拓展奖（D.B.）提供支持。<....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 M KCl | Unisense | ||
| 5 mL 无滴漏血清移液管，独立包装，纸/塑料，袋装，无菌 | CellTreat | 229091B | |
| 10 mL 无滴漏血清移液管，独立包装，纸/塑料，袋装，无菌 | CellTreat | 229092B | |
| 15 mL 离心管 - 泡沫架，无菌 | CellTreat | 229412 | |
| 24 孔组织培养板，无菌 | CellTreat | 229124 | |
| 25 mL 无滴漏血清移液管，独立包装，纸/塑料，袋装，无菌 | CellTreat | 229093B | |
| 35 mm 培养皿 | No. 1.5 盖玻片 | 20 mm 玻璃直径 | 未包被 | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| 50 mL 离心管 - 泡沫架，无菌 | CellTreat | 229422 | |
| 70% 乙醇 | BP82031GAL | BP82031GAL | |
| 70 μm 细胞筛网，独立包装，无菌 | CellTreat | 229483 | |
| 1,000 µL 长款低吸附移液器吸头，成排排列，无菌 | CellTreat | 229037 | |
| 两性霉素 B（Fungizone）溶液 | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
| 生物安全柜 | Nuaire | NU-425-600 | II 级 A/B3 型 |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Bioreagents | BP1605-100 | |
| 细胞回收溶液 | Corning | 354253 | 细胞解离溶液 |
| DMEM/F-12（高级 DMEM） | Gibco | 12-491-015 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Fisher Scientific | 15017CV | |
| 胎牛血清 | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
| G418 硫酸盐 | Corning | 30-234-CR | |
| 硫酸庆大霉素 | IBI Scientific | IB02030 | |
| HEPES，游离酸 | Cytiva | SH30237.01 | |
| HP Pavilion 2 合 1 14" 笔记本电脑 Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
| 盐酸 | Fisher Scientific | A144C-212 | |
| 培养箱 | Fisher Scientific | 11676604 | |
| iPhone 12 相机 | Apple | ||
| L-谷氨酰胺 | Cytiva | SH3003401 | |
| 大尺寸 Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 精细任务擦拭纸，单层 | Fisher Scientific | 34133 | |
| M 205 FA 体视显微镜 | Leica | ||
| Matrigel 基质胶 354234 | Corning | CB-40234 | |
| MC-1 UniMotor 控制器 | Unisense | ||
| 甲基红 | |||
| MM33 微操纵器 | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | 右手型 |
| MS-15 电动载物台 | Unisense | ||
| Nanoject-II | Drummond | 3-000-204 | 纳升级自动注射仪 |
| 青霉素/链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15-140-148 | |
| pH 微电极 | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | SensorTrace 软件不兼容 Apple 计算机 |
| 参比电极 | Unisense | REF-RM-001652 | SensorTrace 软件不兼容 Apple 计算机 |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
| 智能手机相机适配器 | Gosky | ||
| 专用实验室支架 LS | Unisense | LS-009238 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.025%，含酚红 | Gibco | 25-200-056 | |
| UniAmp | Unisense | 11632 | |
| United Biosystems Inc MINI 细胞刮刀 200/包 | Fisher | MCS-200 | |
| Y-27632 二盐酸盐 | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
| µSensor 校准试剂盒 | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 和 9.21，20 mL 袋装 |
参考文献
- Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
- Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (....
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重印与许可
