基于量子点纳米珠的荧光侧向流免疫分析法

摘要

本文介绍了一种量子点纳米微球（QDNB）的制备方法，以及利用基于QDNB的侧向层析免疫检测试纸条检测疾病生物标志物的方案。检测结果可在15分钟内通过紫外光照射进行定性判读，或使用荧光试纸条读数仪进行定量测定。

摘要

量子点（又称半导体纳米晶体）是用于生物成像和传感的新型荧光标记物。然而，通过繁琐的纯化步骤制备的尺寸较小（约10 nm）的量子点-抗体偶联物，在使用侧向流动免疫层析试纸条检测某些痕量疾病标志物时，灵敏度有限。本文介绍了一种采用一步乳化蒸发法制备量子点纳米微球（QDNB）的方法。利用所制备的QDNB，构建了一种荧光侧向流动免疫分析方法，并以C-反应蛋白（CRP）为例检测疾病生物标志物。与单个量子点纳米粒子不同，量子点纳米微球-抗体偶联物由于在一个聚合物复合微球中包封了数百个量子点，实现了信号放大，因而作为免疫分析标记物具有更高的灵敏度。此外，QDNB较大的尺寸有利于在与抗体偶联时进行更简便的离心分离。基于QDNB的荧光侧向流动免疫层析试纸条被成功制备，可在15分钟内完成样本中CRP浓度的检测。检测结果可在紫外光照射下进行定性评估，并在15分钟内使用荧光读板仪进行定量测定。

引言

侧向流动免疫分析（LFIA）试纸条是现场快速检测的关键工具^1,2，尤其在疫情流行期间的疾病筛查中具有重要作用。然而，传统的胶体金基LFIA试纸条检测灵敏度较低，且仅能提供定性结果³。为了提高LFIA的检测灵敏度，多种新型纳米颗粒被开发应用，包括彩色乳胶颗粒^4,5、上转换荧光纳米颗粒⁶、时间分辨荧光微球^7,8以及量子点^9,10,11。量子点（QDs）^12,13，又称半导体纳米晶体，具有可调的发射波长、宽广的激发范围和高发光效率，是生物成像的理想标记物。

然而，单个量子点发出的荧光信号仍然较弱，导致免疫分析中的检测灵敏度相对较低。将大量量....

方案

本研究经上海皮肤病医院机构审查委员会批准（编号：2020-15）。所有涉及人血样本的实验操作均在生物安全二级实验室中进行。本研究所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 量子点纳米微球的制备

注意：量子点纳米珠的合成采用乳液-溶剂蒸发法，油相与水相的比例为1:5。微乳液的制备如下 通过 超声处理后，通过溶剂（氯仿）蒸发使纳米微珠固化。使用氢氧化钠催化纳米微珠表面酸酐基团的水解，将其转化为羧基。

1. 油相和水相溶液的制备
   1. 制备1 mL油相：0.4 mL聚（苯乙烯-共-马来酸酐）（PSMA）溶液（50 mg/mL），0.1 mL量子点（QDs）溶液（100 mg/mL），用氯仿补足体积至1 mL。
   2. 制备5 mL水相：十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液（0.5 wt %）。
2. 乳液的制备与固化
   1. 将1 mL油相和5 mL水相加入一个样品瓶（15 mL）中，并将样品瓶置于磁力搅拌器上。开启磁力搅拌器电源。
   2. 待油相和水相完全混合后，立即将样品瓶转移至程序设定的超声处理仪中（60 s，3 s脉冲后接3 s暂停，50%振幅），并开启电源。
   3. 观察超声处理后的溶液。初始呈深红....

结果

QDNB 的制备流程如图1A所示。将含有量子点（QDs）和聚合物的氯仿油相与水相混合，通过超声处理形成微乳液。通过氯仿的缓慢蒸发使乳液固化。QDNB 的透射电子显微镜（TEM）图像见图2A。QDNB 呈球形形貌，根据 TEM 图像中 50 个 QDNB 的测量结果，其平均直径为 96 nm。在纳米珠内部可清晰观察到量子点纳米颗粒，表明封装成功。图2B 和 图2D 分别展示了 QDNB 的荧光光谱和吸收光谱。

采用碳二亚胺化学法将QDNB与抗体进行偶联，如图1B所示。使用QDNB-抗体偶联物制备基于QDNB的侧向流动免疫分析（LFIA）。LFIA的结构如图1C所示。若样本中存在C反应蛋白（CRP）抗原，QDNB-抗CRP偶联物将在.......

讨论

本文介绍了一种量子点纳米珠（QDNB）²⁷的制备方法，以及利用QDNB制备荧光侧向流动免疫分析（LFIA）的方法。文中展示了对样本中C反应蛋白（CRP）进行定性和定量检测的应用。这种基于QDNB的LFIA还可用于其他疾病生物标志物^25,32、食品毒素^29,30、病毒^16,27等多种目标物的检测。

本方案中的关键步骤是QDNB及QDNB-抗体偶联物的制备。应优化QDNB的粒径以及纳米微珠中的量子点含量，以获得在侧向流动免疫分析（LFIA）中荧光信号强且背景信号低的QDNB。捕获抗体与检测抗体配对对免疫分析至关重要，应从不同供应商中筛选出最佳匹配的抗体对。抗体与QDNB的偶联条件需要优化，包.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(二甲氨基)丙基-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma-Aldrich	03450
吸水纸	金碧生物技术	CH37K
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	B2064
酪蛋白	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS量子点	苏州迈世莱特科技有限公司	CdSe/ZnS-625
氯仿	国药集团化学试剂有限公司	10006818
CRP抗体	海思特生物科技	4C28
荧光侧向层析检测仪	苏州赫尔门斯精密仪器有限公司	FIC-H1
玻璃纤维垫	金碧生物技术	SB06
羊抗兔IgG	生工生物工程	D111018
硝酸纤维素膜	Satorious	CN140
聚（苯乙烯-马来酸酐）共聚物	Sigma-Aldrich	S458066
兔IgG	生工生物工程	D110502
十二烷基硫酸钠	国药集团化学试剂有限公司	30166428
氢氧化钠	国药集团化学试剂有限公司	10019718