利用热 shift 测定法探究底物与硒蛋白 O 的结合

摘要

本文介绍了热位移分析法，这是一种高通量、基于荧光的技术，用于研究小分子与目标蛋白质的结合。

摘要

确定功能未知蛋白质的生物学重要性是理解细胞过程中的一个重大障碍。尽管生物信息学和结构预测已为未知蛋白质的研究提供了帮助， 体外 实验验证常常受到生化活性所需最佳条件和辅因子的限制。辅因子的结合不仅对某些酶的活性至关重要，还可能增强蛋白质的热稳定性。这一现象的一个实际应用是利用蛋白质熔解温度的变化来检测配体结合，即通过测量蛋白质热稳定性的改变来实现。

热移实验（TSA）可用于分析不同配体与目标蛋白的结合，或寻找有助于开展实验（如X射线晶体学）的稳定条件。本文将描述一种利用假激酶Selenoprotein O（SelO）进行TSA的实验方案，该方法简单且适用于高通量检测金属离子和核苷酸的结合。与经典激酶不同，SelO以倒置构型结合ATP，催化AMP基团转移至蛋白质的羟基侧链，这一过程称为蛋白质AMP化修饰，属于一种翻译后修饰。通过分析蛋白熔解温度的变化，我们可深入揭示SelO功能背后的分子相互作用机制。

引言

人类蛋白质组的大部分仍缺乏充分表征。Dunham 和 Kustatscher 等人描述的“"路灯效应"指的是这样一种现象：已被广泛研究的蛋白质持续获得更多的关注，而研究较少的蛋白质则被忽视^1,2。导致这一效应的因素包括某些蛋白质的生物学重要性及其与疾病的相关性。此外，已有的基础性研究成果以及可用于功能分析的工具的可获得性，进一步推动了对这些高关注度蛋白质的研究^1,2。诸如“未充分研究蛋白质计划”（Understudied Proteins Initiative）、结构基因组联盟（Structural Genomics Consortium）和酶功能计划（Enzyme Function Initiative）等项目，旨在利用结构蛋白质组学和功能蛋白质组学手段对研究不足的蛋白质进行表征^2,3,4。一种互补的方法是研究这些未充分表征蛋白质与小分子之间的相互作用，从而深入了解其调控机制和底物特异性。

小分子的结合可提高蛋白质的热稳定性⁵。这一现象被称为配体诱导的构象稳定作用，通常会导致蛋白质熔解温度的升高，从而为配体结合提供可测量的指示信号⁶。蛋白质的热稳定性可通过差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry, DSF）进行测定，该方法也被称为 Thermofluor 或热迁移分析（Thermal Shift Assay, TSA）^7,8,9,10。在 TSA 中，蛋白质样品在环境敏感型染料存在下经历逐渐升高的温度⁶。随着蛋白质的展开和变性，染料会结合到暴露出的蛋白质疏水区域并发出荧光。外源性荧光染料或环境敏感型染料本身不具有内在荧光，而是在与靶分子相互作用后才产生荧光^9,11,12。其中最常用的染料 SYPRO Orange 具有多项优势，例如更高的稳定性以及极低的背景荧光^8,9,12。值得注意的是，SYPRO Orange 的激发波长和发射波长分别约为 470 nm 和 570 nm，因此可与实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）系统兼容。这一独特特性使其能够利用 RT-PCR 系统中常见的荧光检测装置，实现高通量、高精度和高灵敏度的测量⁸。

热迁移分析（TSA）是一种多功能工具，可用于研究蛋白质与潜在辅因子或药物之间的相互作用，并用于确定有利于晶体学研究的稳定条件。与其他筛选方法相比，该技术具有操作相对简便、通量高的优势，可使用96孔或384孔板进行实验^13,14,15。该技术的发展对药物发现研究产生了变革性影响，不仅使用便捷，还能够研究多种添加剂（如离子、配体和药物）的作用^6,16。此外，TSA具有良好的可扩展性，促使科研人员拓展其应用范围，使其能够在筛选实验的同时测定结合亲和力^17,18。在结构生物学研究中，TSA是一种有效的工具，可用于识别促进目标蛋白稳定的结晶条件¹⁹。因此，由于其灵活性和操作简便性，TSA已成为蛋白质表征研究中的核心技术之一。本文将以TSA分析金属离子和核苷酸与研究尚不充分的假激酶Selenoprotein O（SelO）之间的结合为例进行说明。

激酶是药物发现中最受关注的蛋白家族之一²⁰。据预测，约10%的人类激酶因缺乏催化所必需的关键催化残基而无活性，被称为假激酶^21,22。硒蛋白O（SelO）是一种进化上保守的假激酶，其催化HRD基序中缺乏保守的天冬氨酸残基²³。在真核生物中，SelO定位于线粒体，并保护细胞免受氧化应激损伤^24,25。结构与生化分析表明，SelO可将腺苷一磷酸（AMP）从ATP转移至蛋白底物，这一过程称为AMP化修饰，属于一种翻译后修饰²⁵。近期研究表明，催化AMP化的酶在体外可能结合UTP等替代性核苷酸in vitro^26,27。值得注意的是，已有研究证明鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中的SelO同源蛋白可在依赖锰离子的条件下催化蛋白UMP化，即UMP的转移反应²⁸。鉴于这些引人注目的发现，我们检测了SelO在镁离子和锰离子存在下与ATP和UTP的结合能力，以此作为热迁移分析（TSA）应用的代表性示例。以下实验方案可轻松调整，用于优化并研究其他目标蛋白与添加剂之间的相互作用。

方案

1. 实验设置

1. 使用能够检测荧光的热循环仪（例如 RT-PCR 仪器）进行本方案所述操作。若使用本方案中所述的 SYPRO Orange 染料，请采用激发波长约 470 nm、发射波长检测约 570 nm 的扫描模式。将热循环仪程序设置为：先在 20 °C 下保持 2 分钟，随后以 0.5 °C/1 分钟的速率升温至 95 °C；每升高 1 °C 测定一次荧光强度。
   注意：我们建议在循环结束后增加一个可选步骤，即将样品槽温度恢复至 20 °C（图 1）。
2. 每个反应包含四个组分：缓冲液、目标蛋白、添加剂和外源性荧光染料。实验设计时应包括以下对照：无蛋白、无染料、无添加剂的蛋白以及仅含添加剂的对照，以确定可能影响结果解读的背景荧光。如有条件，可设置阳性对照，例如已知可结合并稳定目标蛋白的添加剂。
3. 使用纯化的蛋白进行检测。以本示例为例，使用大肠杆菌（E. coli）SelO 蛋白，其表达与纯化方法如前文所述^25,29。简言之，在 Rosetta DE3 细胞中表达 His-sumo 标签的 SelO（E. coli SelO ppSumo），并通过 Ni²⁺-NTA 亲和层析进行纯化。随后使用 Ulp 蛋白酶切除 His-sumo 标签，并通过凝胶过滤层析进一步纯化 SelO。
4. SYPRO Orange 的荧光信号取决于其与目标蛋白的相互作用。由于不同蛋白与染料的相互作用存在差异，需优化蛋白和染料的浓度，以获得最佳的信噪比。
   注意：SYPRO Orange 与某些蛋白或添加剂（如去垢剂）不兼容^11,30。必要时可筛选 ¹² 中列出的其他外源性荧光染料。

2. 确定最佳染料浓度（图 2A）

1. 从以DMSO配制的5,000x储备液中，分别制备50x、40x、30x、20x和10x的SYPRO Orange稀释液，每种20 µL 。
2. 将用TSA缓冲液稀释至6.25 µM的蛋白溶液各8 µL分别加入384孔PCR板的六个独立孔中。
   注：在本示例中，我们使用以下TSA缓冲液进行稀释：10 mM Tris（pH 8）、150 mM NaCl和1 mM DTT。样品可设置三个重复以提高结果的可靠性。
3. 向每个孔中加入1 µL TSA缓冲液。
   注：在优化染料和蛋白浓度后，该体积的缓冲液将被小分子溶液替代。
4. 向每个孔中加入1 µL不同浓度梯度的SYPRO Orange染料溶液。在最后一个孔中加入1 µL不含染料的缓冲液，作为空白染料对照。
5. 用光学透明的压敏封膜覆盖PCR板。
6. 将PCR板放入配备PCR板转子的离心机中，在1,000 × g条件下短暂离心1分钟。
7. 将PCR板放入实时荧光定量PCR仪中，并启动步骤1.1中描述的热循环程序。

3. 确定最佳蛋白浓度（图2B）

1. 使用TSA缓冲液（10 mM Tris pH 8、150 mM NaCl和1 mM DTT）配制25 µM、12.5 µM、6.25 µM、3.125 µM和1.56 µM的蛋白系列稀释液，每种20 µL。
2. 将蛋白的连续稀释液各 8 µL 分别加入 384 孔板的五个独立孔中。
3. 仅在6号位分配缓冲液^th 以及无蛋白质对照。
4. 每孔加入 1 µL TSA 缓冲液。
   注意：在优化染料和蛋白质浓度后，此体积的缓冲液将被小分子替换。
5. 向每个孔中加入 1 µL 的 50 倍稀释 SYPRO Orange 染料溶液。
6. 用光学透明的粘性膜覆盖平板。
7. 短暂离心平板，1,000 × g 使用配备PCR板适配器的离心机离心1分钟。
8. 将培养板放入RT-PCR仪中，并启动步骤1.1中所述的热循环程序。

4. 设置TSA实验（图3A）

注意：在优化蛋白质和SYPRO Orange染料浓度后，可通过加入目标小分子进行检测，以分析其结合情况。

1. 通过考虑重复次数和适当的对照来确定条件的数量。
   注意：例如，我们将以三复孔检测 SelO 与八种条件的结合。包括对照（无添加剂、无蛋白、无染料），我们共有 11 个反应 × 3（三复孔）= 共计 33 个反应。
2. 根据 SelO 观察到的蛋白和染料最佳浓度，确保每个反应包含 8 µL 的 6.25 µM 蛋白、1 µL 添加剂和 1 µL 的 50x SYPRO Orange 染料，总体积为 10 µL。因此，所用终浓度为 5 µM 蛋白和 5x SYPRO Orange 染料。
3. 使用 TSA 缓冲液配制 288 µL 的 6.25 µM 蛋白溶液。该体积的蛋白工作液可满足 36 个反应（33 个反应并额外增加 10% 以补偿移液误差）。
4. 将 8 µL 的 6.25 µM 蛋白分别加入 384 孔板的不同孔中。对于无蛋白对照孔，仅加入缓冲液。
5. 加入 1 µL 浓度为 10x 的小分子溶液，使其终浓度为 1x。以本示例为例，加入 1 µL 的 20 mM MgCl₂ 溶液，使其终浓度为 2 mM。对于无添加剂对照孔，仅加入缓冲液。
6. 向每孔加入 1 µL 的 50x SYPRO Orange 染料溶液。
7. 用光学透明的压敏封膜覆盖板孔。
8. 将板置于配备 PCR 板转子的离心机中，在 1,000 × g 下短暂离心 1 分钟。
9. 将板放入 RT-PCR 仪中，并启动步骤 1.1 中描述的热循环程序。

5. 数据分析

1. 从实时荧光定量 PCR 仪导出相对于温度（°C）的相对荧光单位（RFU）数据。
2. 使用选定的软件提取并绘制每条熔解曲线至其测得的最大荧光强度为止的数据点。重要的是，需确认无蛋白和无染料对照组表现出较低的背景荧光，且荧光信号不随温度升高而增加（图 3A、B 和 补充表 S1）。可使用免费开放的软件（如 MoltenProt³¹ 或 DSFWorld³²）进行数据分析。
3. 采用 Boltzmann Sigmoidal 拟合方法对数据确定熔解温度。熔解温度（T_m）定义为观察到 50% 蛋白变性或荧光强度达半最大值时的温度（图 3C）。
4. 熔解曲线中的热漂移可能提示存在稳定或去稳定作用的添加剂。计算熔解温度变化值（T_m）的公式为：T_m = T_m 添加剂 _- T_m 缓冲液。正值表示具有稳定作用的条件或相互作用的添加剂；负值表示具有去稳定作用的条件（图 3D）。

结果

真核生物的SelO由N端线粒体靶向序列、一个激酶样结构域以及位于蛋白质C末端的高度保守的硒代半胱氨酸组成²³。这种定位于线粒体的酶含有一种假激酶结构域，该结构域从细菌到人类均保守存在²³。对Pseudomonas syringae中SelO同源蛋白的结构分析显示，其活性位点的氨基酸发生改变，使得ATP以与经典激酶相反的方向结合²⁵。因此，SelO催化多种参与抗氧化信号通路的蛋白质发生AMP化修饰，而非磷酸化修饰，从而保护细胞免受氧化损伤和细胞死亡²⁵。除了AMP化之外，一些原核和真核AMP化酶还被证实能够催化UMP化修饰^27,28。

我们使用纯化的重组 E. coli SelO 进行 TSA 实验，以检测 ATP 和 UTP 核苷酸在二价阳离子存在下与 SelO 的结合情况。与典型的激酶类似，SelO 含有 DFG 基序，其中天冬氨酸可结合金属离子，从而在活性位点协调核苷酸的结合。首先，我们优化了 TSA 中蛋白质和染料的浓度，确定 5 µM 至 10 µM 的 E. coli SelO 与 5 倍浓度的 SYPRO Orange 搭配使用效果最佳（图 2）。此外，我们发现无蛋白质以及无染料的对照组荧光信号均较低，且不随温度升高而发生变化。我们检测到在 ATP-Mg²⁺ 和 ATP-Mn²⁺ 存在时，E. coli SelO 的热稳定性分别提高了约 +4 °C 和 +12 °C（图 3）。然而，在与 UTP 孵育时，我们未观察到热稳定性的变化，表明 E. coli SelO 可能不与 UTP 发生可检测的结合。

图1：PCR仪设置。 本示例展示了用于PCR仪的程序设定，以+0.5 °C/min的速率升高样品温度，同时使用FRET通道检测SYPRO Orange荧光。建议在程序开始和结束时均包含室温孵育步骤。缩写：FRET = Förster共振能量转移。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：蛋白质和染料浓度的优化。（A）使用 5 µM Escherichia coli SelO 优化 SYPRO Orange 染料浓度的代表性结果。（B）使用 5 倍稀释的 SYPRO Orange 染料优化 E. coli SelO 浓度的代表性结果。热变性曲线显示了相对荧光单位（y 轴）随温度（x 轴）的变化。结果为三个重复孔的平均值 ± 标准差（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3:热变性曲线和ΔT_m 在存在核苷酸和二价阳离子条件下的SelO分析。 （A） 样品（5 µM）热变性曲线的原始数据 大肠杆菌 在含有200 µM ATP或UTP、2 mM二价阳离子和5倍SYPRO Orange的条件下，从RT-PCR仪导出数据并作图。SelO ATP-Mg表示含有SelO、ATP和MgCl₂的样品₂，SelO ATP-Mn 表示含有 SelO、ATP 和 MnCl 的样品₂，SelO UTP-Mg 表示含有 SelO、UTP 和 MgCl 的样品₂，SelO UTP-Mn 代表含有 SelO、UTP 和 MnCl 的样品₂注意，无染料和无蛋白对照组显示出低荧光。结果为三次重复孔的均值 ± 标准差（n = 3）。 (B) 热变性曲线根据最高强度绘制，并采用Boltzmann S型方程进行拟合。尽管SelO的热变性不受UTP影响，但在ATP存在下，我们观察到热变性发生显著偏移（紫色曲线）。结果为三个复孔的均值±标准差（n = 3）。 (C) 直方图显示 T_m 由数据的Boltzmann S形拟合得出的值 图3B结果代表三个复孔的平均值 ± 标准差（n = 3）。SelO 39.2 °C ± 0.085，SelO ATP-Mg 43.3 °C ± 0.133，SelO ATP-Mn 50.9 °C ± 0.085，SelO UTP-Mg 39.1 °C ± 0.056，SelO UTP-Mn 39.9 °C ± 0.087。 (D) 直方图显示熔解温度变化 ΔT_m (T_m 添加剂_- T_m 缓冲液）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充表 S1：存在金属和核苷酸时 SelO 的 TSA 分析示例数据。 从 RT-PCR 仪器导出的原始数据电子表格，以及经过处理删除了协议步骤 5.1 和 5.2 中所述最大 RFU 强度后数值的数据。请点击此处下载该文件。

讨论

热移实验（TSA）是一种高效筛选蛋白质-配体相互作用的方法，包括与辅因子和抑制剂的相互作用。在本实验方案中，我们利用TSA检测假激酶SelO与核苷酸及二价阳离子的结合能力。研究结果表明，SelO在ATP以及Mg²⁺/Mn²⁺存在时表现出更高的热稳定性。该观察结果与先前报道一致，即来自大肠杆菌（E. coli）、酿酒酵母（S. cerevisiae）和人（H. sapiens）的SelO同源蛋白能够催化ATP上的AMP基团转移至蛋白质底物的羟基侧链上^25,29。尽管TSA可为核苷酸结合提供有价值的线索，但它无法确定体内的真实底物。除底物外，其他分子也可能影响蛋白质的热稳定性。要准确鉴定底物，还需考虑细胞内浓度和结合亲和力等因素。尽管如此，TSA仍是一种优秀的工具，可用于通过热稳定性变化作为读数，高通量筛选大量条件，例如小分子的结合情况。

TSA 的用途不仅限于分析小分子与蛋白质活性位点或调节位点的结合。TSA 通过提供稳定条件，使蛋白质更有利于进行晶体学实验，从而显著推动了蛋白质的生物物理表征。值得注意的是，TSA 具有多种优势，包括实验设置简单，以及利用常见的实验室材料（如 PCR 板和 RT-PCR 仪器）实现高通量检测的能力。这些优势使得大量条件的筛选成为可能，而这些条件若采用其他技术则可能难以实现或操作复杂。已有多个研究利用 TSA 结合化合物库测定重组蛋白的热稳定性，以确定蛋白质结晶的最佳条件^19,33。

设置适当的对照对于避免熔解曲线的误读至关重要，其中微孔板或添加剂的自发荧光是常见的干扰因素。对于具有自发荧光或能淬灭SYPRO Orange荧光的化合物，热迁移稳定性分析（TSA）可能不适用。一种可能的解决方案是筛选文献¹²中描述的替代荧光染料。本文所述的TSA方案可轻松适用于其他感兴趣的蛋白质及添加剂。添加剂不仅限于水溶性化合物，正如本方案中以核苷酸和二价阳离子为例所示。实际上，添加剂可涵盖多种条件，例如不同pH值、配体或以DMSO溶解的药物⁸。此外，将配体与蛋白质预先孵育可能有助于减少染料带来的干扰和假象，从而获得更可重复的结果。脂质和去垢剂等添加剂可能因与SYPRO Orange相互作用而产生高荧光背景。图3A展示了一条典型的变性曲线示例，显示较低的背景荧光，并在蛋白质发生热变性时出现明显的荧光增强。染料与蛋白质的最佳浓度应能实现最大的信噪比，同时在重复实验中保持稳定的荧光信号。

TSA 的优势在于其组分简单，从而减少了需要优化的变量数量。关键步骤包括确定染料和蛋白质的最佳浓度。需要注意的是，TSA 需要使用经过纯化的、"性质良好"的蛋白质。蛋白质及其添加物必须在 TSA 所用浓度下于缓冲液中保持稳定。容易发生聚集或寡聚化的蛋白质或实验条件可能导致荧光读数出现错误。聚集或去折叠的蛋白质可能在初始时即表现出较高的荧光信号，变性后仅略有增加。蛋白质的寡聚化还可能导致出现多个转变状态，使数据分析复杂化¹⁰。可通过精细调整蛋白质浓度以防止聚集发生。

TSA 可与多种缓冲液和盐类兼容，能够优化蛋白质和添加剂的稳定条件¹¹。可通过调整蛋白质和添加剂溶液的体积，以克服蛋白质和添加剂浓度的限制。例如，可使用较低浓度的添加剂（如 5 倍浓度）代替代表性结果中所用的 10 倍浓度溶液。值得注意的是，由于 384 孔 PCR 板可容纳低至 10 µL 的总样品体积，进行该检测所需的蛋白质和添加剂用量较少。

鉴于热迁移分析（TSA）的优势，它非常适合用于研究尚未充分了解的蛋白质，例如假激酶。假酶是一类在结构上与活性酶同源但无催化活性的蛋白质³⁴。最近的结构与生物化学研究表明，少数假酶实际上具有酶活性，而大多数则执行非催化功能^35,36。尽管缺乏催化活性，假酶仍与多种疾病相关，并在支架作用和变构调节等过程中发挥重要作用³⁷。然而，许多假酶的作用机制及其功能意义尚不清楚。一些假酶的活性受配体结合的调控，配体结合会导致其热稳定性升高，这与蛋白质的构象变化相关¹⁴。我们提出，TSA 是一种有价值的工具，可用于检测配体与假酶的结合，从而确定实现其功能活性的最佳配体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物	Sigma Aldrich	A2383-10G	用于代表性结果，但非执行TSA所必需
Avanti J-15R 带微孔板载具组件	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 实时荧光定量PCR系统	Bio-Rad	12011452
硬壳384孔PCR板，薄壁，带裙边，透明/白色	Bio-Rad	HSP3805
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266-100G	用于代表性结果，但非执行TSA所必需
四水合氯化锰(II)	Sigma Aldrich	M3634-500G	用于代表性结果，但非执行TSA所必需
Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘合剂，光学级	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange 蛋白凝胶染色剂	Sigma Aldrich	S5692-500UL
尿苷-5′-三磷酸三钠盐水合物	Sigma Aldrich	U6625-100MG	用于代表性结果，但非执行TSA所必需