本方案描述了采用改良的四血管阻塞法诱导脑缺血性昏迷模型的过程。
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本文内容
摘要
摘要
由脑缺血引起的昏迷是脑缺血最严重的并发症。四血管阻塞法可用于建立脑缺血性昏迷模型，服务于疾病研究和药物开发。然而，传统的四血管阻塞方法主要通过将电凝笔插入颈部后方第一颈椎两侧的翼状孔，对椎动脉进行电凝。该操作存在电凝不完全、出血以及损伤脑干和脊髓的风险。术后24小时，需对大鼠再次麻醉，并在颈部前方进行颈动脉结扎。两次手术使大鼠感染风险升高，且延长了实验周期。本研究中，在一次手术过程中采用颈前入路，定位椎动脉穿入第一颈椎的关键部位，在直视下对双侧椎动脉进行电灼，并分离双侧颈总动脉以预先置入松结。当大鼠四肢开始抽搐时，迅速结扎双侧颈总动脉，从而诱导缺血性昏迷。该方法可避免因两次手术带来的感染风险，操作简便且成功率高，为相关研究人员提供了有价值的参考。
引言
缺血性脑损伤是临床实践中最常见的脑损伤，约占脑血管疾病病例的75%。缺血可导致严重的继发性脑损伤和疾病1,2，而昏迷是缺血缺氧性脑损伤引起的最严重症状，也是多种危重病症的最终通路3。昏迷是临床实践中一种危重且难以处理的严重病症4。昏迷持续时间越长，潜在危险越大。及时促醒是防止病情恶化和进展的首要目标。尽管纳洛酮注射液在促醒方面具有广泛的临床应用，但仍存在一些副作用5。因此，开发安全有效的促醒药物是一个亟待解决的重要问题。建立一种简便易行的脑缺血性昏迷模型，对于阐明缺血性昏迷的发病机制以及新药研发至关重要6,7,8。
本研究旨在介绍一种通过电凝双侧椎动脉（VA）和暂时性结扎双侧颈总动脉（CCA）来诱导全脑缺血性昏迷的模型，该模型操作简便，适合初学者使用。先前的方案涉及在第一次手术中暴露第一颈椎后方的双侧翼孔，并通过电灼翼孔以阻断双侧椎动脉；24小时后进行第二次手术，通过结扎双侧颈总动脉诱导完全性缺血性昏迷
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方案
实验方案严格遵循佛山科学技术学院实验动物使用与管理伦理委员会的要求（记录编号：2023-643656）。本研究选用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重200 g ± 20 g，6-8周龄）。所有动物实验数据均按照ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南撰写。研究中所用试剂与设备的详细信息见《材料表》。
1. 脑电图电极的植入
- 在麻醉前15分钟，皮下注射0.05 mg/kg的阿托品，以预防分泌物引起的呼吸道阻塞和窒息。通过肌肉注射给予20 mg/kg的唑拉西泮和5 mg/kg的赛拉嗪以麻醉大鼠14。使用镊子夹住大鼠脚趾以确认深度麻醉状态。
- 使用剃毛器去除大鼠头部的毛发。使用非穿透性耳杆将大鼠头部固定于脑立体定位仪上。用无菌棉球以乙醇和聚维酮碘对术区皮肤进行三次消毒。
- 使用手术刀沿矢状缝切开大鼠头部皮肤。剥离覆盖颅骨的肌肉组织，充分暴露颅骨。在整个过程中使用无菌棉签控制出血。
- 使用洗耳球吹干颅骨表面，以利于牙科水泥牢固粘附。用黑色记号笔标记颅钉（直径1.2 mm，长度3 mm）的安装位置（图1，步骤1），具体位置包括前囟点及另外四个位点。
- 使用10 mL注射器针头依次旋转钻孔四个区域，并依....
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结果
由于电极植入引起的炎症及其他刺激，脑电图（EEG）可能不稳定，因此大鼠需要恢复3天。3天后脑电图和肌电图（EMG）正常的大鼠方可用于昏迷模型的制备。麻醉状态下，大鼠的脑电图和肌电图活动轻度受抑，但仍保持平稳。双侧椎动脉电凝阻断后，脑电图和肌电图活动无明显变化。约30分钟后，药物代谢完毕，大鼠逐渐恢复意识，脑电图和肌电图活动增强。当大鼠出现肢体抽动，且脑电图与肌电图信号活跃、不再呈直线时，迅速结扎颈总动脉（CCA）。此时，负责脑部供血的四条血管均被阻断，导致全脑缺血。脑电图和肌电图活动迅速受到抑制，几乎呈直线，大鼠不再挣扎，眼球呈现灰白色（图2A）。若大鼠无法进入昏迷状态，则表明模型制备失败。
30分钟后，释放颈总动脉（CCAs）的第一根结扎线以恢复灌注，但保留在颈总动脉前方的第二根结扎线仍维持较低的灌注水平，从而使大鼠持续处于昏迷状态约60分钟。随着机体逐渐代偿和血液灌注的恢复，大鼠逐渐苏醒（图2B）。大鼠苏醒后，脑电图（EEG）和肌电图（EMG）几乎完全恢复正常.......
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讨论
四血管阻塞可诱导全脑缺血和缺氧性脑损伤，能够模拟临床上由脑缺血引起的急性昏迷、心脏骤停、窒息、休克、严重心律失常等危重临床状况。同时，四血管阻塞主要导致海马区损伤17,18，而海马是负责认知记忆功能的主要脑区19,20,21。因此，四血管阻塞也可用于模拟血管性痴呆模型22,23。综上所述，四血管阻塞诱导的全脑缺血模型已被广泛用于模拟上述临床疾病。
1979年，Pulsinelli等人10通过阻断双侧颈总动脉和双侧椎动脉，实现了全脑缺血与再灌注。自此以后，该模型逐渐成为国际公认的全脑缺血模型的经典制备方法
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（82173781 和 82373835）、博士后科研项目（BKS212055）、佛山市科技局科技创新项目（2320001007331）、广东省基础与应用基础研究基金（2019A1515010806）、广东省普通高校重点领域项目（智能制造）（2020ZDZX2057）以及广东省普通高校科学研究项目（特色创新）（2019KTSCX195）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16通道微纤维光电极阵列 | Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd | 2605 | |
| 4-0外科缝合线 | Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd. | B-104 | |
| 6-0外科缝合线 | Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd. | JM1216-742417 | |
| 脑电图电极 | Kedou Brain machine Technology Co., LTD | KD-EEGEMG | |
| 电凝笔 | CONPUVON Company | 465 | |
| Lunion Stage自动睡眠分期系统 | 上海 lulian 智能科技有限公司 | 1336 | |
| 微型手持式颅骨钻 | Rayward Life Technology Co., Ltd | 87001 | |
| 青霉素钠 | 成都科龙化工有限公司 | 17121709-2 | |
| SD大鼠 | SPF (北京) 生物技术有限公司 | 180-220g | |
| 颅骨钉 | GLOBALEBIO,LTD | / | |
| 立体定位仪 | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68801 | |
| Zoletil 50 | Vic Trading (Shanghai) Co., LTD | BN 88SHA |
参考文献
- Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
- Rong, M., et al.
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重印与许可
