荧光肽酶谱:一种在 Zymogram 凝胶中使用荧光底物检测蛋白酶活性的改进技术

Zymography 是一种电泳技术，涉及与聚丙烯酰胺凝胶共聚的蛋白质底物来检测水解酶及其活性。首先，将样品溶解在含有甘油、十二烷基硫酸钠或 SDS 和溴酚蓝的酶谱缓冲液中。

甘油使样品缓冲液比凝胶周围的运行缓冲液更稠密，从而能够轻松上样到凝胶袋中。SDS（一种阴离子洗涤剂）使样品中的酶变性并涂上负电荷。溴酚蓝 - 一种示踪染料 - 有助于监测凝胶中的样品进展。

样品加载到嵌入荧光底物的聚丙烯酰胺凝胶中，以检测蛋白酶活性。现在，连接电极并开始电泳。产生的电场导致所有 SDS 结合的酶通过凝胶迁移到带正电的电极。

电泳完成后，取出凝胶并在含有非离子去垢剂的再生缓冲液中洗涤，该去垢剂取代SDS以允许酶再生。接下来，将凝胶在含有激活凝胶中酶的二价阳离子的显影缓冲液中孵育。

活性蛋白酶裂解荧光底物，导致荧光增加。对凝胶进行成像以观察荧光蛋白条带，其强度与蛋白酶活性成正比。

首先，将样品溶解在传统的酶造影样品缓冲液中。向凝胶装置中加入 400 毫升 1x Tris-甘氨酸 SDS 运行缓冲液。每孔最多可加载 35 微升样品。在 4 摄氏度下以 120 伏的电压运行样品 1.5 小时，或直到分子量标准品表明目标蛋白酶位于肽分离凝胶层内。之后，从塑料盒中取出凝胶。

室温下轻轻搅拌下在再生缓冲液中洗涤凝胶三次，每次洗涤持续10分钟。将凝胶转移到显影缓冲溶液中 15 分钟。然后，用新鲜的显影缓冲液替换溶液，并在 37 摄氏度下轻轻搅拌孵育 24 小时。之后，使用带有适当激发和发射滤光片的荧光凝胶扫描仪/成像仪对凝胶进行成像。