MSC接种支架制备：一种用于制备可植入小鼠模型的间充质干细胞接种支架的技术

癌细胞产生趋化性归巢因子，以吸引血管中的间充质干细胞（MSCs）向肿瘤部位迁移。

为了在体外研究这些细胞对肿瘤生长的影响，首先取一块灭菌的支架基质。将其转移至含有所需培养基的孔板中，以预湿支架。将其放置在干燥表面，去除附着在支架上的多余培养基，以利于细胞更好地黏附。将部分干燥的支架转移至新的孔中。在支架上接种一滴间充质干细胞（MSC）悬液。

此外，在孔板的角落加入更多培养基，以形成保湿环境，防止后续孵育过程中液滴的培养基蒸发。孵育以使间充质干细胞（MSCs）贴附于支架表面。将支架翻转，暴露未接种细胞的一面。在此侧用移液器加入一滴新鲜的MSC悬液，并让MSC贴附。

当MSCs已黏附于支架两侧后，加入更多培养基，确保所有细胞均与培养基接触。继续培养，直至MSCs生长并浸润至支架的间隙和孔隙中。接种了MSCs的支架即可用于外科植入。

在植入小鼠前48小时准备支架，首先将PLA支架切割成约2×2毫米大小、与切除腔尺寸相匹配的片状。将支架浸入70%乙醇中15分钟以进行灭菌。15分钟后，将支架浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后，在准备细胞接种的同时，将支架置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）中。

制备细胞时，首先使用 0.05% 胰蛋白酶消化培养的间充质干细胞（MSCs）。在 37°C 下孵育 5 分钟。孵育结束后，确认细胞已脱落。然后向培养瓶中加入 DMEM 以中和胰蛋白酶活性。接着将培养瓶中的内容物转移至 15 毫升离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，通过在 100 × g 条件下离心 5 分钟，为每个支架收集 5 × 10⁵ 个 MSCs 细胞沉淀。

离心后，吸除上清液，并将间充质干细胞（MSCs）重悬于每 5 × 10⁵ 个细胞加入 5 µL DMEM 的培养基中。然后，用镊子从 DMEM 浸泡液中取出支架，置于 6 孔板的盖子上。将支架轻轻提起，使多余的 DMEM 液滴留在盖子上。再将支架放回盖子上的另一个干燥位置。重复此操作 3 至 5 次。随后，将部分干燥的支架转移至新的 6 孔板中，用于细胞接种。

部分干燥的支架可获得最佳的细胞接种效果。如果支架过于湿润，细胞会从支架表面滑落并黏附到下方的培养板上。如果支架过于干燥，液滴将无法在整个支架表面铺展，导致初始细胞分布不均。

使用移液器轻轻吹打MSC细胞管，使细胞悬液混匀，因为部分细胞可能已沉降至管底。缓慢吸取2.5 µL新鲜混匀的MSC悬液，直接滴加在支架表面，在支架上方形成一小滴液滴。向每孔边缘加入300 µL DMEM，以防止细胞液滴过快蒸发。将培养板置于37°C孵育30分钟，使细胞充分贴附于支架上。

孵育后，用镊子轻轻将支架在培养板中翻转。接种 2.5 µL 新鲜混合的间充质干细胞（MSC）悬液，使每个支架接种的细胞总数达到 5 × 10⁵ 个。孵育 30 分钟以使细胞贴附于支架后，向 6 孔板的每孔中加入 2 mL DMEM 培养基覆盖支架。轻轻抬起支架，使培养基能够流至其下方。在 37 °C 条件下继续孵育 48 小时，随后进行植入手术。