病毒噬菌斑测定:一种通过定量病毒感染细胞单层中形成的噬菌斑来测量传染性单纯疱疹病毒的技术

首先，在缓冲液中制备单纯疱疹病毒（一种包膜传染性病毒）的连续稀释液。

获得含有单层病毒敏感上皮细胞培养物的多孔板。用稀释的病毒悬浮液代替特定体积的培养基，确保均匀的单层覆盖。让病毒吸附到细胞表面。

去除任何未吸附的病毒。用含甲基纤维素的培养基覆盖细胞单层，形成半固体覆盖层。

孵育后，病毒包膜和细胞膜融合，将包围双链基因组的病毒核衣壳释放到细胞质中。此外，病毒基因组被释放到细胞核中。

宿主的细胞机制和病毒粒子蛋白，病毒基因组表达即刻早期病毒蛋白，调节早期基因的表达。早期病毒蛋白介导病毒 DNA 复制。

然后，晚期病毒基因表达结构蛋白，这些结构蛋白与病毒基因组一起组装产生后代病毒粒子颗粒。病毒感染的细胞裂解，释放病毒粒子。

甲基纤维素限制病毒运动，导致病毒粒子仅感染邻近细胞并随后裂解，从而在单层上形成孔洞。

孵育后，去除甲基纤维素覆盖层。加入乙醇结晶紫溶液。乙醇固定细胞并灭活病毒，而结晶紫则对细胞进行染色。结果，紫色细胞单层上出现明显的裂解区或斑块。

每次病毒稀释时计数每个孔中的斑块，以确定传染性病毒滴度或浓度。

使用移液器从一个或两个孔中取出细胞培养基。小心地，将稀释的病毒样品逐滴添加到每个单层细胞中，通过每个孔的侧面

每隔一两个孔重复该过程，直到整个板都充满被斑块的病毒样品。用手轻轻摇晃整个盘子。

然后，将板在37摄氏度下孵育1小时，让病毒吸附。每 10 分钟后，将板从培养箱中取出，再次轻轻摇晃，使病毒更均匀地分布在每个孔中，然后将其放回培养箱中。

为了减少无意中计数未吸收的接种物的可能性，请使用 1,000 微升移液器吸头从孔中取出病毒样品，并将样品丢弃在废烧杯中。

将 2.5 毫升甲基纤维素覆盖层放在板上，然后将其放回培养箱中。在将废烧杯从生物安全柜中取出之前，通常添加漂白剂、碘伏或类似的杀病毒剂对废烧杯进行消毒。

孵育两天后，使用移液器一次从一两个孔中取出甲基纤维素覆盖层，并将其放入废烧杯中。向每个孔中加入约 2 毫升 1% 结晶紫和 50% 乙醇。将板与所有充满染色剂的孔一起在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

此时，对废烧杯进行消毒，如前所述。用自来水用力清洗板，直到径流清晰。

确保每个稀释系列的斑块数量存在大约 10 倍的差异。