Name: 에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 학습하세요 세포 표면에 고정된 수용체-리간드 상호작용 동역학을 적혈구 센서를 이용한 접착 빈도 분석법으로 측정하는 방법을. 이 기법은 세포 접착 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH 보조금 R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 및 R01GM096187 지원했다.

1. 전체 혈액에서 RBCs 절연 <ol><li> EAS - 45 솔루션을 준비합니다. 테이블 내의 모든 재료를 무게 및 DI 워터 100 - 200ml에 용해. 1000ml 솔루션을 만들고 8.0 산도를 조정하기 위해 물을 추가합니다. 50ml에 의해 필터 나누어지는. 스토리지 -20 ° C에서 고정. </li></ol> 참고 : 단계 1.0 기관 검토위원회 승인을 프로토콜과 함께 간호사로 훈련 의료 전문가 등에 의해 수행되어야합니다. <ol start="2"><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함 10ml 튜브에 평균 cubital 정맥에서 혈액 3 - 5ml를 그려 부드럽게 즉시 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 혈액을 혼합하고 철저하게 염증을 막을 수 있습니다. </li><li> 공정 혈액 샘플 가능한 한 빨리. 원심 분리를 제외한 모든 다음 단계는 준비가 멸균 유지하는 후드를 완료해야합니다. , 50ml 원심 튜브에 혈액을 전송 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 추위와 무균 1077 Histopaque 및 원심 분리기의 10ml를 추가 두 번 반복합니다. </li><li> 10 추가ML 추위와 멸균 PBS, 5 분 @ 1000rpm을위한 원심 분리기, 4 ° C. 뜨는을 제거합니다. 4 번 (5 번 총) 반복합니다. </li><li> 두번 무균 EAS​​ - 45 (5 분 @ 1000rpm, 4 ° C)로 씻으십시오. 새로운 멸균 15ml 튜브에 마지막으로 세척 이동 RBCs 동안. </li><li> Resuspend RBCs in10ml EAS - 45. </li></ol> 2. RBCs에 biotinylation <ol><li> 1 단계에서 RBCs로 튜브를 가져가라. 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 centrifuging 후 모든 뜨는을 제거 여러 개의 튜브 각 RBCs 펠렛의 10μl를 넣고 (6 다양한 RBCs의 biotinylation의 농도의 준비 예를 들어 표 II 참조) 각 유리병에 PBS의 해당 금액을 추가합니다. </li><li> 표 II에 따라 신선한 Biotin-X-NHS/DMF 1시 10분, 1:100 dilutions하십시오. </li><li> 각 유리병에 0.1M borate 버퍼 10μl를 추가합니다. </li><li> 즉시 계산 각 유리병에 비오틴 솔루션의 금액 (예를 들어 표 II 참조)하고 와동을 추가합니다. </li><li> 각 RBC의 약병 장소50ml 원뿔 튜브 및 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어 내부. </li><li> 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 800μl로 각 유리병 3 번씩 씻으십시오. </li><li> 4 각 유리병 및 저장하는 EAS - 45의 100μl를 추가 ° C. 최종 솔루션의 각각 1μl에 지금 RBCs의 ~ 1mln해야합니다. </li></ol> 3. RBCs에 비오틴 - 연결된 리간드 *을 Functionalizing <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 2mg/ml streptavidin 용액을 준비합니다. Aliqouted 솔루션은 -20 ° C.에 저장될 수 있습니다 </li><li> 즉시 streptavidin 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 2.7 (10μl)에서 RBCs의 동일한 금액을 혼합하고 4 30 분에 대한 회전에 품어 ° C. </li><li> 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 500μl 3 번 씻으십시오. 15μl EAS - 45 스토리지 / 1 % BSA를 추가합니다. </li><li> 즉시 20μg/ml 리간드 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 3.3 (10μl)에서 RBCs의 같은 양을 혼합하여 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어. </li><li> 중 500μl로 두 번 씻으 EAS -2min @ 2000rpm에 대한 1분의 45 %의 BSA. 스토리지 EAS - 1분의 45 %의 BSA의 15μl를 추가합니다. </li></ol> * 귀하의 단백질이 더 비오틴 링크가 없다면 당신은 단백질 biotinylation에 대한 상용 키트 중 하나를 (예를 들어, 써모 과학은 # 21955 EZ - 링크 마이크로 NHS - PEG4 - Biotinylation 키트)를 사용하거나 그림과 같이 중간 단계로 biotinylated 캡처 항체를 사용하여 동영상 인치 4. 수용체와 리간드 밀도의 부량 <ol><li> 각 mAbs의 포화의 농도와 다른 유리병, 수용체 - 베어링 세포 상온에서 30 분 동안 3 단계의 리간드 - 코팅 RBCs를 품어합니다. 제어를위한없는 isotype 검색 항체와 함께 별도의 튜브 세포에 품어. 기본 항체가 찬란 표시되지 않는 경우에는 제조 업체의 지시에 따라 찬란 - 복합 차 항체와 함께 품어. </li><li> 해당 형광 칼과 흐름 cytometery에 의해 단계 4.1 준비 샘플 분석ibration 비즈. 로 그림에 표시된 밀도를 계산합니다. 1. </li></ol> 5. micropipette과 셀 챔버 준비 <ol><li> PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러 또는 셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러를 사용하여 모세관 튜브에서 micropipettes를 가져옵니다. </li><li> 원하는 크기 (보통 1 - 5μm에서 필요한 직경 범위 연구에 사용되는 세포의 크기에 따라)에 뽑아 micropipette의 팁을 조정 microforge과 micromanipulator를 사용하십시오. </li><li> 원하는 크기로 현미경 커버 유리를 절단하여 셀 챔버를 준비합니다. 실험 중에 osmolarity를​​ 변경하는 중간 증발을 방지하기 위해 양쪽에서 미네랄 오일을 사용하여 챔버를 밀봉합니다. </li><li> 실로 수용체와 리간드 - 베어링 세포를 추가합니다. </li></ol> 6. Micropipette 부착 주파수 분석 <ol><li> 각 pipettes하여 상호 작용하는 세포를 기음과 컴퓨터 프로그램 piezoelectr를 사용하여 IC 번역은 제어 문의 공간 및 시간이 다른 세포와 접촉 밖의 RBC를 운전합니다. 세포 분리시 RBC의 연신율을 관찰하여 접착 이벤트를 감지. </li><li> 주어진 접촉 시간에 대한 문의 - 철회주기에게 50-100 번 반복합니다. Excel 스프레드 시트의 열에서없이 접착을위한 접착 또는 "0"에 대한 "1"을 추가하여 관찰 부착 이벤트를 기록합니다. 당신은 미세한 이미지, 예를 들어, 디지털 미디어 또는 비디오 테이프를 녹화 장치를 사용할 수 있습니다. </li><li> 부착 주파수 대 의미와 SEM을 얻기 위해 각 접촉 시간에 적어도 세 가지 다른 세포 쌍을 사용하여 문의 시간 곡선을 기록합니다. </li><li> 그들의 구체적인 기능 봉쇄의 mAbs를 사용하여 리간드 또는 수용체를 차단없는 리간드 (예 : BSA) 및 / 또는 코팅 RBCs를 사용하여 컨트롤에 대한 특이 현상이 바인딩 커브를 기록합니다. 각 연락처 시점에서 특정 접착 주파수는 특이 현상이 부착 주파수 1 제거하여 계산하실 수 있습니다. </li></ol>ove_title "&gt; 7. 데이터 분석 <ol><li> 특정 부착 주파수를 맞추기 P 전달 두번째 순서와 첫 순서 수용체의 단일 수종과 리간드 1 단일 종 사이의 역방향 단일 단계 상호 작용을 설명하는 확률적 모델 (수식 1)에 의해 비교 ​​문의 시간 t 데이터 : <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="방정식 1"> K는 2D 효과적인 바인딩 친화력은 K가 오프 오프 요금은, M R 및 M 난 4 단계에서 측정한 각각의 수용체와 리간드 밀도뿐입니다이며, C는 접촉 영역입니다. 곡선 맞춤가 C와 K가 효과적인 2D 친화 함께 일괄와 총칭이라고 같이 두 개의 매개 변수, C K A와 K 임무를 가지고 있습니다. 오프 속도의 제품은 효과적인 2D에서 속도입니다 C K에 = C K X K 해제. 구체적인 접착력 주파수 P는 전체 측정 부착 (P 측정) 1,21에서 특이 현상이 부착 분율 (P 특이 현상)의 뺄셈으로 계산됩니다 : <img alt="방정식 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="방정식 2"></li></ol> 8. 대표 결과 : <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 인테 그린 α L의 β neutrophils 2 사이트 밀도의 1 결정을 그림. Neutrophils 먼저 그림 3,4 또는 E - selectin - IG없이 사용하는 실험 조건을 일치하는 10 분에 대해 E - selectin - IG의 1μg/ml와 incubated 후 PE - 복합 백신의 포화의 농도 (10μg/ml)로되었습니다 인간 CD11a mAb (복제 HI111 특정 표를 참조시약 및 장비) 또는 컨트롤에없는 마우스 IgG1은 씻어하고, 즉시 분석했다. 샘플은 표준 QuantiBRITE PE 교정 비즈와 BD LSR 흐름 cytometer에 읽어되었습니다. 패널 A는 E - selectin - IG 처리 (파란색) 또는 치료 세포 (녹색)의 사람과 함께 교정 비즈의 형광 histograms (분홍색)을 보여줍니다. 특정 CD11a mAb의 얼룩은 고체 곡선과 관련이없는 isotype 검색 컨트롤 항체 얼룩이 곳곳에 곡선에 표시됩니다에 표시됩니다. 치료 세포와 비교에서 본대로 E - selectin - IG (모든 세탁 단계와 FACS 버퍼에 존재) 대우 세포는 CD11a 밀도에 영향을주지 않았다. 패널 B는 밀도 부량 과정을 보여줍니다. Log10는 패널에서 네 개의 교정 비드 histograms의 각 피크 값의 평균 형광 강도 (FI)에 대한 계산 (핑크 원)와 구슬 당 많은 특정 PE 분자에 대한 (제조 업체). Log10 fluoresc에 대한 비드 당 Log10 PE 분자의 선형 회귀줬어도 꾸몄다되었습니다. E - selectin 취급 전지 respectivly 3.99 (파란색 고체 동그라미)와 특이적인 mAb 및 제어 항체에 대해 2.23 (파란색 오픈 동그라미), 동등한 Log10 FI (Y) 값. 우리는 X (값이 패널 B에 녹색과 파란색 동그라미로 꾸몄다 있습니다)에 대한 선형 방정식을 해결 X = Log10 PE PE로 / 세포와, :., neutrophils에서 α L의 β 2의 총 숫자는 mAb 비율이 1시 1분 있었다 9587으로 계산. 표면 밀도는 호중구 직경 22로 8.4μm를 사용하여, 43 분자 / μm의 두 것으로 계산되었다. ICAM - 1의 밀도는 마찬가지로 65 몰 / μm의 2 말았네 PE - 안티 인간 CD54 mAb를 사용하여 플로우 cytometery에 의해 측정되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2 Micropipette 시스템 설계도. 우리 micropipette 시스템은 집에서 조립 세 서브 시스템으로 구성되어 있습니다되었습니다 이미징 서브 시스템을 하나, 레크 리에이션을 관찰할 수 있도록오드 및 분석 micropipette - aspirated 세포의 움직임, 하나 셀 챔버에서 세포를 선택할 수 있도록 미세 조작 서브 시스템 및 압력 서브 시스템은 하나 micropipettes로 세포를 대기음 수 있습니다. 이미징 서브 시스템의 중앙 조각은 100x 기름 침지 1.25 NA의 목적으로 (올림푸스 IMT - 2 IMT2) 현미경을 반전합니다. 이미지는 무료 커플 장치 (CCD) 카메라를 통해 비디오 카세트 레코더로 전송됩니다. 비디오 타이머는 시간을 추적할 수있는 시스템으로 결합됩니다. 각 micropipette은 현미경에 장착된 가늘게 3 축 유압 micromanipulator와 위치 기계적 드라이브로 조작하실 수 있습니다. 뉴 포트에서 기계 manipulators 역시 사용될 수 있습니다. micropipette 홀더 중 하나가 압전 변환기에 탑재의 드라이버는 압전 액추에이터에 전압 앰프 (수제)를 통해 컴퓨터를 LabView 코드 (요청시 사용 가능)와 DAQ 보드를 통해 신호 변환에 의해 제어됩니다. 이llows 한 접착 테스트 사이클에서 정확하고 repeatably 피펫 이동합니다. 압력 조절 시스템은 실험 기간 동안 흡입을 제어하는​​ 데 사용됩니다. 유압 라인은 액체 저수지에 micropipette 홀더를 연결합니다. 좋은 기계 포지셔너는 저수지의 높이를 정확하게 조작 수 있습니다. Micropipettes는 KIMAX의 융점 borosilicate 유리 모세관 튜브 (1.0 이외의 직경 ± 0.07 mm와 0.7의 내부 직경 ± 0.07 mm를 사용하여 생성됩니다. 첫째, 모세관 튜브의 micropipettes가 PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러를 사용 행진 (셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러 다른 풀러 옵션입니다.) 둘째, Microforge 시스템 (집에서 만든) 원하는 크기 오프닝에 micropipettes를 잘라하는 데 사용됩니다. Microforge 시스템의 상용 모델뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 실험 microsc 동안 micropipettes의 진동을 방지하려면ope, micromanipulators와 함께 에어 서스펜션 테이블에 배치됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3을 위해서 접착 주파수 F를 실행하는 특정 (A) 및 특이 현상 (B) 1s (빨간색)에 구속하고 10 초 ICAM - 1 (A) 또는 hIgG와 코팅 RBCs 사이에 반복적으로 접착 테스트주기에서 측정 (파란색) 접촉 시간 (B ) 인테 그린 α L의 β 2를 표현하는 인간 neutrophils과 함께. F I = (X 1 + X 2 + ... + X 제가) / 전 (1 제가 테스트주기 색인 ≤ I ≤ N), X 난 "1"동일 (접착) 또는 "0"(노 부착). F N (N = 50)가 부착 확률위한 최상의 견적로 사용되었다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 4 속도론 그림호중구 인테 그린 α L의 β 2 ICAM - 1 바인딩 ( <img alt="스퀘어" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="스퀘어"> ). 측정된 접착 확률은 각 연락처 시간 세 세포 쌍을 그림 3에 나와 평균입니다 문의 시간 대 꾸몄다. 챔버 매체 α의 L의 β에게이 바인딩을 upregulate하는 1mM 칼슘 2 각 + 및 MG 2 dimeric의 + 플러스 1μg/ml E - selectin - IG와 HBSS했다. , RBCs에서 ICAM - 1 - IG를 캡처하기 위해 중간 단계는 streptavidin 보육 단계 후 10μg/ml 캡처 항체 (biotinylated 염소 - 안티 인간 FC 항체, eBioscience)와 RBCs를 부화 추가되었습니다. 특이 현상이 구속력이 두 가지 조건을 제어하는​​ 데 사용되었다 : 1)는 RBCs로 코팅된 아닌 반 인간 FC 캡처 항체로 코팅하고 그 대신 RBCs에 바인딩 ICAM - 1 - IG (O)과 2) neutrophils 인간의 IgG와 incubated (Δ) 항체를 캡처합니다. 10μg/ml 인간 IgG는 E의 바인딩 최소화하는 매체에 추가되었습니다RBC 표면에 캡처 항체에 용액에 - selectin - IG. 인간 IgG 제어 곡선로 기록 특이 현상이 바인딩은 특정 부착 확률 곡선을 (얻기 위해 사용되었다 <img alt="스퀘어" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="스퀘어"> ) EQ를 사용하여. 2. EQ와 피팅 특정 부착 확률 곡선. 1 (실선)은 효과적인 구속력 친화력 C K = 1.4 • 10 -4 μm4와 K 해제 = 0.3의 -1를 반환했습니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> MW (g / 몰) </th><th> 농도 (㎜) </th><th> 금액 (G) </th></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 135.13 </td><td> 이 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> D - 포도당 (덱스 트로 오스) </td><td> 180.16 </td><td> 110 </td><td> 19.82 </td></tr><tr><td> D - Mannitol </td><td> 182.17 </td><td> 55 </td><td> 10.02 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> 58.44 </td><td>50 </td><td> 2.92 </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 (나 HPO ) </td><td> 141.95 </td><td> 20 </td><td> 2.84 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 146.15 </td><td> 10 </td><td> 1.46 </td></tr></tbody></table> 표 1. EAS - 45 버퍼 준비 (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> DMF의 550 μl 25 MG 비오틴 - XHS </td><td> 0.1M 비오틴 솔루션 </td></tr><tr><td> 0.1 비오틴 W / DMF의 1시 10분 희석 </td><td> 0.01M 비오틴 솔루션 </td></tr><tr><td> 0.1 비오틴 W / DMF의 1:100 희석 </td><td> 0.001M 비오틴 솔루션 </td></tr></tbody></table> 표 2. 비오틴 솔루션의 준비. <table border="1"><tbody><tr><th> 비오틴 최종 농도 (μm의) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBCs 펠렛 주식 (μl) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1X PBS (μl) </td><td> 179.2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176.8 </td></tr><tr><td> 0.1M borate 버퍼 (μl) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0.01M 비오틴 솔루션 (μl) </td><td></td><td></td><td></td><td> 일 </td><td> 이 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> 0.001M 비오틴 솔루션 (μl) </td><td> 0.8 </td><td> 이 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. RBCs의 Biotinylation.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공적으로 한 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다 micropipette 부착 주파수 분석을 사용합니다. 첫째, 관심의 수용체 - 리간드 시스템의 구체적인 상호 작용을 기록해야합니다. 특이 현상이 제어 측정 (그림 참조하라. 3, 4)는 특이성을 보장합니다. 이상적으로, 특이 현상이 부착 확률은 접촉 시간에 대한 기간이 0.05 이하이어야하며 각 시점에 대한 구체적이고 특이 현상이 부착 확률 사이의 상당한 차이를 가지고 있습니다. 다른 방법은 몇 RBCs의 표면에 리간드를 사용할 수 있습니다. 그것은 방법 17 커플링 크롬 염화은 비오틴 - streptavidin 커플링보다 특이 현상이 바인딩의 높은 수준을 준 것으로 나타났습되었다. 둘째, 특정 상호 작용에 대한 부착 확률이 중간 범위에 있어야합니다. 이 요구 사항은 수용체가 constitutively 세포에 표현하는 경우 수용체와 리간드 (또는 RBCs에서만 리간드의 밀도 변화에 의해 충족 수 있습니다...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17 - 517Q </td><td> 사용하기 전에 탈이온수와 1X로 희석 </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> BD </td><td> 366,643 </td><td> RBCs 절연 </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 10,771 </td><td> RBCs 절연 </td></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A2786 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> D - 포도당 (덱스 트로 오스) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G7528 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> D - Mannitol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 6360 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S7653 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 (나 &amp; # X2082; HPO ₄) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S374 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G5763 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> 비오틴 - X - 보건국 </td><td> Calbiochem </td><td> 203,188 </td><td> RBCs에 biotinylation </td></tr><tr><td> Dimethylformamide (DMF) </td><td> 써모 과학 </td><td> 20,673 </td><td> RBCs에 biotinylation </td></tr><tr><td> Borate 버퍼 (0.1M) </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 11455-90 </td><td> RBCs에 biotinylation </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> 써모 과학 </td><td> 21,125 </td><td> functionalizing 리간드 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A0336 </td><td> functionalizing 리간드 </td></tr><tr><td> Quantibrite PE 비즈 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340,495 </td><td> 밀도 부량 </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> BD Immunocytometry 시스템 </td><td> BD LSR II </td><td> 밀도 콴tification </td></tr><tr><td> 모세관 0.7 - 1.0mm X 30 &quot; </td><td> 킴블의 유리 주식 회사 </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipette 당겨 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP2629 - 1 </td><td> 상공 회의소 조립 </td></tr><tr><td> 현미경 커버 유리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-544 - G </td><td> 상공 회의소 조립 </td></tr><tr><td> PE α - 인간 CD11a 클론 HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Fig.1을위한 시약 </td></tr><tr><td> PE 안티 인간 CD54 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Fig.1을위한 시약 </td></tr><tr><td> 마우스 IgG1 Isotype 제어 PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Fig.1을위한 시약 </td></tr><tr><td> 유압 micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MO - 303 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> 기계 조작하는 사람 </td><td> 뉴 포트 </td><td> 461 - XYZ - M, SM - 13, DM - 13 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> 압전 번역 </td><td> Physik Instrumente </td><td> P - 840 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> 내쇼날 인 스트 루먼트 </td><td> 버전 8.6 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> DAQ 보드 </td><td> 내쇼날 인 스트 루먼트 </td><td> USB - 6008 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> 광학 테이블 </td><td> 동력학 시스템 </td><td> 5200 시리즈 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr></tbody></table>

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

micropipette 부착 분석은 2 차원 (2D) 수용체 - 리간드 바인딩 속도론 1 측정하기 위해 1998 년에 개발되었습니다. 분석은 부착 센서와 상호 작용하는 분자 중 하나를 제시 세포로 인간의 적혈구 (RBC)를 사용합니다. 그것은 정확하게 제어 영역과 결합 형성을 활성화하기 위해 시간과 다른 상호 작용하는 분자를 표현 다른 세포와 접촉에 RBC를 가지고 미세 조작을 사용합니다. 접착 이벤트가 떨어져 두 세포를 당기시 RBC의 신장으로 감지됩니다. RBC 표면에 고정화 리간드의 밀도를 조절하여 접착의 확률은 0과 1 사이의 미드 레인지에 보관됩니다. 유착 확률은 주어진 접촉 시간이 두 세포 사이의 접촉 반복주기의 순서에 유착 사건의 주파수 추정된다. 연락처 시간을 변화하는 것은 바인딩 커브를 생성합니다. 바인딩 수용체 - 리간드 반응 속도론 1 확률적 모델 피팅곡선은 2D 친화력과 오프 속도를 반환합니다. 분석은 IgG FC 1-6 glycoconjugate 리간드 6-9, 리간드 10-13, homotypical cadherin 구속력이 14 펩타이드 - 주요 histocompatibility의 단지 15 T 세포 수용체와 coreceptor과 integrins와 selectins과 Fcγ 수용체의 상호 작용을 사용하여 검증되었습니다 - 19. 방법은, 같은 멤브레인 microtopology 5, 멤브레인 앵커 2, 분자 오리 엔테이션 및 길이 6, 캐리어 강성 9, 곡률 20과 충돌 힘 20,뿐만 아니라 생화 학적 요인 biophysical 요소에 의해 2D 속도론의 규정을 계량하는 데 사용되었습니다 상호 작용하는 분자가있는 cytoskeleton과 멤브레인 microenvironment하고 이러한 분자 15,17,19의 표면 조직의 모듈 레이터 등. 방법은 t에도 사용되고 있습니다O는 수정된 모델 21를 사용하여 이중 수용체 - 리간드 종 3,4의 동시 구속, 19 trimolecular 상호 작용을 공부합니다. 방법의 주요 장점은 자신의 기본 멤브레인 환경에서 수용체 연구를 허용한다는 것입니다. 결과는 정화 수용체 17를 사용하여 얻은 이들의 매우 다른 수 있습니다. 또한 잘 전형적인 생화학 방법을 넘어 시간적 해상도를 가진 하위 초 timescale에있는 수용체 - 리간드 상호 작용의 연구를 수 있습니다. micropipette 부착 주파수 방법을 설명하기 위해, 우리는 α L의 β 2 활성화 솔루션에 dimeric E - selectin과 neutrophils에서 인테 그린 α L의 β 2 구속력 RBCs에 작용 세포 유착 분자 1 (ICAM - 1)의 속도론 측정을 보여줍니다.

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

마이크로피펫 접착 분석법(micropipette adhesion assay)은 2차원(2D) 수용체-리간드 결합 역학을 측정하기 위해 1998년에 개발되었습니다1. 이 분석법은 인간 적혈구를 사용합니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 두 분자가 모두 상호작용하는 세포 표면에 고정되었을 때의 수용체-리간드 상호작용 역학을 측정하는 것입니다. 이는 우선 접착 센서인 적혈구를 리간드로 기능화하고, 수용체를 발현하는 세포를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 마이크로 피펫 챔버를 조립하고 접착 테스트를 수행하여 접착 이벤트를 기록합니다.다음으로, 세포 접촉 시간에 따른 부착 확률 곡선을 도식화하고 모델에 적합시킵니다. 반응 속도론적 파라미터를 추정하기 위해, 데이터로부터 추정된 2차원 유효 결합 친화도와 해리 속도를 보여주는 결과를 도출합니다. 그렇다면 이 분석법의 아이디어는 어디에서 얻었을까요?연구자들은 수용체-리간드 상호작용을 연구합니다. 주로 파단력을 측정하며 저희 또한 동일한 작업을 수행하고 있으나, 어느 날 저희는 접착이 없는 경우 0, 접착이 있는 경우 1이라는 이진 결과만을 측정하고, 이러한 0과 1의 측정값으로부터 역학 측정치를 도출하여 마이크로 파이펫 빈도 분석법을 보여줄 수 없을까 생각하게 되었습니다. 저희 실험실의 연구 과학자인 Veronica Zana Zina 박사가 여러분께 해당 실험을 보여드릴 것입니다.전혈에서 분리한 적혈구를 접착 빈도 분석을 위해 비오틴화합니다. 이 절차를 시작하려면, 분리된 적혈구가 담긴 튜브를 원심분리하고, 적혈구 펠렛 10 µL를 여러 개의 바이알에 각각 분주한 다음, 각 바이알에 해당 양의 PBS를 추가하여 다양한 농도의 적혈구 비오틴 희석액을 준비합니다. 그다음, 각 바이알에 0.1 M borate buffer 10 µL를 추가합니다.그 다음, 계산된 양의 biotin 용액을 각 바이알에 넣고 즉시 볼텍싱합니다. 각 적혈구 바이알을 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고, 실온의 로테이터에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 각 바이알에 EAS 45 버퍼를 넣고 2000 rotations per minute에서 2분 동안 원심분리합니다. EAS 45 버퍼를 이용한 세척 과정을 2회 더 반복하여 총 3회 세척합니다.마지막으로, 각 바이알에 100 µL의 EAS 45 버퍼를 추가하고 4 °C에서 보관하여 적혈구 표면의 리간드를 기능화합니다. 이전 단계에서 비오틴화된 적혈구를 4 °C에서 포화 농도의 strep TTR과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, EAS 45 버퍼로 2000 rpm에서 2분 동안 세 번 세척합니다. 그 후, 적혈구를 비오틴화된 리간드

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이 비디오에서는 HEK 세포 응집 분석을 통해 시냅스 세포 접착 분자 간의 세포 간 상호 작용을 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 분석에서는 원하는 시냅스전 세포 접착 분자와 형광 단백질을 발현하는 동일한 수의 HEK 세포를 시냅스후 세포 접착 분자 및 다른 형광 단백질을 발현하는 HEK 세포와 혼합합니다. 세포 접착 분자 간의 상호 작용은 세포를 응집시키며, 이는 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다.

Cell Adhesion Molecules 간의 Trans Interaction을 검출하기 위한 Cell Aggregation Assay

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

이 프레젠테이션은 세포간 접합 통신 연구에 부착 배양된 세포의 전기천공법이 사용되는 방법을 보여주며, 세포는 전도성 및 투명 인듐-주석 산화물로 코팅된 슬라이드에서 성장합니다.

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여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

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우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

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이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

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이 연구는 유틸리티 양적 세포 막 확장 측정 및 셀의 접착 능력의 상관 관계의 용이성을 보여 줍니다. 대표적인 예로 우리 보여 여기 그 Dickkopf 관련 단백질 3 (DKK3) 증가 lobopodia 형성을 촉진 하 고 adrenocortical 암 접착 력 셀 세포 생체 외에서.

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혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

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여기서, 우리는 형광 현미경을 사용하여 이종 세포 시스템에서 트랜스에서 리간드 수용체 상호 작용을 신속하고 반정적으로 측정하는 최적화된 프로토콜을 제시한다.

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

학습하세요 세포 표면에 고정된 수용체-리간드 상호작용 동역학을 적혈구 센서를 이용한 접착 빈도 분석법으로 측정하는 방법을. 이 기법은 세포 접착 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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