İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli
8 Mart 2014
Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.
Bu prosedürün genel amacı, insan kemik iliğinin hücresel ve hücre içi mikroortamını yakından taklit eden bir kültür sistemi kurmaktır. İlk olarak, bir doku kültürü kuyusunun yüzeyi endüstriyel matris ile kaplanır. Ardından kemik iliği mononükleer hücreleri veya ilgilenilen diğer hücreler kemik iliği matrisi ile karıştırılır.
Daha sonra, endüstriyel matris uzaklaştırılır ve hücre-matris karışımı kuyucuğa eklenir. Matris jelleştikten sonra, üzerine büyüme medyumu eklenir. Sonuç olarak hücreler, mevcut hücre kültüre alma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, doğrudan matris içinde görüntülenebilir veya alt analizler için izole edilebilir.
Örneğin, standart doku kültürü yöntemleri veya hücrelerin plastik üzerinde büyütüldüğü ko-kültür modelleri. 3D kültür yöntemi kullanmanın temel avantajı, hücrelerin fizyolojik mikro çevre içerisinde büyütülmesidir ve bu sayede hücreleri dokunun doğal koşulları altında incelemenize olanak tanır. Hücrelerin ekileceği 48 kuyucuklu bir plaka hazırlayın.
Her birine önce 65 µL endüstriyel kaplama çözeltisi ekleyerek, çözeltiyi kuyucuğun tüm yüzeyini kaplayacak şekilde eşit olarak yayın. Bu yöntem diğer yüzeylere de ölçeklenebilir. Plakaları oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.
Bu sırada, mikrolitre başına 50.000 hücre içeren PBS hücre süspansiyonunu hazırlayın. Her kuyucuğa 10 mikrolitre ekleyecek kadar hazırlayın, ardından bir eppendorf tüpünde, hücre süspansiyonunu kuyucuk başına 100 mikrolitre rekonstrüktif kemik matriksi ile karıştırın. Nazikçe karıştırın ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.
Plaka işlemi bittiğinde matrisin jelleşmemesi için karışımı buz üzerinde tutun. İnkübasyon sonrası tüm sıvıyı ve kaplama solüsyonunu aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Ardından, her bir kuyucuğa matris içeren ve iyice karıştırılmış hücre süspansiyonundan 100 µL ekleyin.
Kuyucuğun tüm yüzeyini eşit şekilde kaplamak için bir pipet kullanarak plakayı hızlıca eğin. Hücreler tamamen yüklendiğinde kümeleşeceği için, kuyucuklar doldurulurken süspansiyonu karıştırmaya devam edin. Matriks katılaşana kadar plakayı sarsmadan 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.
Ardından, kemik iliği büyüme ortamını 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda önceden ısıtın. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, matriksin uygun şekilde donup donmadığını kontrol edin. İyi bir matriks, plaka eğildiğinde hareket etmeyen yumuşak, jel benzeri bir tabaka oluşturur.
Matriks hazır olduğunda, serolojik bir pipet kullanarak üzerine damla damla 1 mL besiyeri ekleyin. Ardından, hazırlanan yeniden yapılandırılmış kemik matriksi kültürünü, besiyeri değişimi yapmadan 30 güne kadar inkübatöre geri yerleştirin. Eğer besiyeri değişimi gerekirse, her seferinde besiyerinin sadece yarısını değiştirin.
Matriks tabakasını bozmadan besiyerini nazikçe uzaklaştırın. Plakayı eğerek besiyerini bir pipet yardımıyla yavaşça boşaltın. Besiyerini matriks tabakasının üzerinden aspire etmeyin.
Hücreler boyanırken, solüsyon değişimleri için bu tekniği kullanın. 3D kültürün kuyucuklarından medyumu uzaklaştırırken, medyumun kuyucuğun yan tarafından alınması oldukça kritik önem taşır.
Aksi takdirde, matriks bozulacak ve hücreler kaybolabilecektir. Aynı tekniğe bağlı kalarak, hücreleri iki kez steril 1x PBS ile yıkayın. Ardından her birine yarım mililitre buz gibi soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin.
Hücrelerle birlikte tüm matriks tabakasını, pipetle güçlü bir şekilde yukarı-aşağı çekerek uzaklaştıracağız. Her biri için, toplanan materyali bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıp buz üzerine yerleştireceğiz. Ardından, aynı kuyucuğa yarım mililitre daha recovery çözeltisi ekleyip geri kalan tüm materyali toplayacağız.
Tüm koleksiyonları vorteksleyin ve buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Bu bir saatlik süre boyunca, hücrelerin matriksten salınımını kolaylaştırmak için tüpleri her 15 dakikada bir vorteksleyin. Bir saatin sonunda, karışımda görünür matris kümeleri olup olmadığını kontrol edin.
Hiçbiri bulunmamalıdır, ancak mevcutsa, karışımı daha büyük bir tüpe aktarın ve iki ila beş mililitre ek hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Ardından hücreleri 30 ila 60 dakika daha inkübe edin. Periyodik olarak vorteksleyin ve matris kümelerinin yokluğunu tekrar kontrol edin.
Matriks artık topaklanmadığında, karışımı 4 °C'de 1000 RPM'de beş ila 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından süpernatanı uzaklaştırın ve hücre peletini 1 mL soğuk 1X PBS içinde yeniden süspande edin.
Santrifüj işlemini tekrarlayın. Süpernatantı taze PBS ile değiştirin ve yıkama işlemini tekrarlayın. Üçüncü kez.
Üçüncü PBS yıkamasından sonra, hücreleri bir sonraki prosedür için uygun olan çözeltide geri kazanın. Kemik iliği hücreleri, yeniden yapılandırılmış kemik matrisinde 30 gün boyunca büyütülmüş ve ışık mikroskobu ile 200 kat büyütmede periyodik olarak görüntülenmiştir. Stromal elementler ilk olarak beşinci günde tespit edilmiş, ancak 14. güne gelindiğinde belirgin şekilde görünür hale gelmişlerdir.
Kültür süresi boyunca hücreler matris boyunca göç etmiş ve belirgin kümeler halinde bir araya gelmiştir. RBM'de aşırı büyüyen stromal bileşenlerin kompozisyonunu değerlendirmek amacıyla, malign hücre kütleleri zamanla genişletilmiştir. RBM ile endüstriyel kaplama arasındaki geçiş bölgesindeki hücrelerin morfolojisi değerlendirilmiştir.
Hücreler fibronectin, aktin ve çekirdekler için boyandı. Stromal morfolojiye sahip hücrelerin görselleştirilmesi, yüksek alkali fosfataz aktivitesine sahip prek-osteoblastlar olduklarını göstermiştir. Bunların, zarin red boyaması ile belirlendiği üzere kalsiyumu mineralize etme yeteneğine sahip oldukları görülmüştür. Lipid damlacıklarının görünür olduğu hücreler, oil boyamasıyla pozitif sonuç vermeleri nedeniyle adipositler olarak tanımlanmıştır.
Ara sıra çok çekirdekli görülen kırmızı hücreler pres osteoklastlar olarak tanımlanmış ve tartrat dirençli asit fosfataz için pozitif sonuç vermiştir. Hücrelerin 3D kültürden izole edilmesinin ardından çeşitli çalışmalar yapabilirsiniz. Örneğin, mikroçevrede büyütülen çeşitli hücrelerin hücresel fenotiplerini inceleyebilirsiniz.
Gen ve protein ekspresyonunu inceleyebilir, hatta 3D koşullar altında bu hücreler tarafından ne tür moleküllerin salgılandığını belirleyebilirsiniz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, primer insan kemik iliği hücrelerini kendi doğal mikroçevrelerini taklit eden bir ortamda incelemek için tasarlanmış 3 boyutlu bir kültür sistemini sunmaktadır. Yöntem, hücrelerin doğrudan görüntülenmesine veya ileri analizler için izole edilmelerine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre kültürü teknikleri
- Kemik iliği hücresi davranışı
- 3-D doku mühendisliği
Arka Plan
- Standart kültür yöntemleri hücreleri genellikle fizyolojik ortamlarından uzaklaştırır.
- Kemik iliği hücreleri, fonksiyonelliklerini korumak için belirli koşullara ihtiyaç duyar.
- 3-D kültür sistemleri, in vivo ortamı daha iyi taklit edebilir.
- Bu çalışma, kemik iliği hücresi davranışının anlaşılmasını geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan kemik iliği mikroçevresine yakından benzeyen bir kültür sistemi geliştirmek.
- Primer insan kemik iliği hücrelerinin fizyolojik olarak daha ilgili bir bağlamda incelenmesine olanak sağlamak.
- Kültürlenmiş hücrelerin sonraki analizlarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Doku kültürü kuyucuklarının endüstriyel bir matriks ile kaplanması.
- Kemik iliği mononükleer hücrelerinin kemik iliği matriksi ile karıştırılması.
- Jelleşme sonrası endüstriyel matriksin uzaklaştırılması.
- Hücre-matriks karışımının üzerine büyüme ortamı eklenmesi.
Temel Sonuçlar
- Hücreler doğrudan matris içerisinde görselleştirilebilir.
- İzole edilen hücreler çeşitli alt analizler için kullanılabilir.
- 3-D kültür sistemi, kemik iliği hücresi davranışının incelenmesini geliştirir.
- Sonuçlar, geleneksel yöntemlere kıyasla artırılmış fizyolojik uygunluğa işaret etmektedir.
Sonuçlar
- Geliştirilen 3-B kültür sistemi, kemik iliği ortamını etkili bir şekilde taklit etmektedir.
- Bu yöntem, kemik iliği hücre fonksiyonelliği üzerine yapılan araştırmaları ilerletebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, hematopoez hakkında daha derinlemesine bilgi edinmek için bu sistemden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulanabilirlik Özeti
Primer insan kemik iliği hücrelerinin, doğal hücre dışı matris ipuçlarının kaybı nedeniyle ex vivo ortamda sürdürülmesi zordur ve bu durum hematolojik malignitelerin preklinik modellemesini ve stromal etkileşimleri kısıtlamaktadır. rBM sistemi, primer kemik iliği canlılığını ve fonksiyonunu 30 güne kadar koruyan, fizyolojik olarak ilgili bir 3D mikroortam sağlayarak terapötik adayların mekanistik risk azaltımına olanak tanır. Bu sistem, hücresel kompozisyonu koruyarak ve hücre davranışının ve ilaç yanıtının matris içinde gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine imkan vererek hedef validasyonunu ve preklinik sürekliliği destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Terapötik hipotezlerin doğal benzeri bir stromal bağlamda sorgulanmasına olanak tanıyarak, primer insan kemik iliğindeki yolak bağımlılıklarını netleştirir.
- Operasyonel Değer: Malign ve stromal fenotipler için kritik olan fizyolojik hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimlerini koruyarak fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Öngörücü Değer: Yapay kültür koşullarından kaynaklanan artefaktları azaltarak, hedef etkileşimi ve fenotipik tarama sonuçlarına olan güveni artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Hücre sağkalımı, proliferasyonu ve morfolojisine ilişkin kantitatif okumalarla bileşik taramasına uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir 3B kültürler oluşturur.
- Ölçeklenebilirlik: 48 kuyucuklu plaka formatlarıyla uyumludur ve ön aday belirleme kampanyaları için daha yüksek kapasiteli iş akışlarına adapte edilebilir.
- Tarama Değeri: Primer hücre heterojenliğini ve stromal çapraz etkileşimi koruyan, hastalıkla ilgili bir sistemde yeni terapötiklerin güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Normal donörler ile amiloidoz ve hematolojik malignitesi olan hastalardan alınan primer kemik iliğinin hücresel kompozisyonunu koruyarak, biyobelirteç uyumlu preklinik çalışmaları destekler.
- Preklinik Kullanım: Kültürlenmiş hücrelerin in vivo transplantasyon, akış sitometrisi, nükleik asit ve protein analizleri için izole edilmesine olanak tanıyarak, keşif aşaması ile doğrulama aşaması arasında köprü kurar.
- Risk Ayarlı Kararlar: Stromaya bağımlı ilaç etkilerinin ve direnç mekanizmalarının değerlendirilmesini kolaylaştırarak, erken geliştirme aşamasındaki devam/durdurma (go/no-go) kriterlerini iyileştirir.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
rBM sistemi; hedef doğrulama ile ön lider belirleme ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürecine, özellikle hematolojik maligniteler ve mikroçevreye bağımlı tedaviler için tam olarak uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Primer kemik iliği hücrelerini insan kemiğini taklit eden bir mikroçevrede kültüre ederek hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Hücre canlılığı, kümelenme ve zaman içindeki morfolojik değişiklikler hakkında kantitatif ve tekrarlanabilir çıktılar sağlayarak bileşiklerin karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analitikler: Osteoblast, adiposit ve osteoklast farklılaşması dahil olmak üzere stromal ve malign hücre fenotiplerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesine ve uç nokta analizine imkan verir.
- Translasyonel Araştırma: 3D kültürden transplantasyon ve moleküler profilleme gibi alt fonksiyonel analizlere süreklilik sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve terapötik modalite genelinde primer kemik iliği biyolojisinin incelenmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kemik iliği hedefli ilaç yanıtlarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış matris hazırlama ve kültür bakım prosedürlerine sahip, standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir sistem sunar.
- Stratejik Değer: Fizyolojik olarak ilgili modellerde etkinlik eksikliğinin veya beklenmedik toksisitenin daha erken tespit edilmesini sağlayarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Stromal etkileşim profillerine ve insanla ilgili koşullardaki malign hücre davranışına dayalı olarak adayların riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- 3B hücre kültürü teknikleri ve hücre dışı matris kullanımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Rekonstrükte kemik matrisine ve insan plazması ile desteklenmiş uygun büyüme ortamlarına erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilirliği sağlamak için matris hazırlama, hücre gömme ve ortam kaplama işlemleri için standardize edilmiş eğitim gereklidir.
- Canlılığı veya fenotipi bozmadan jel matristen canlı hücreleri geri kazanmak için alt akış izolasyon protokollerinin adaptasyonunu gerektirir.
- Matrisi bozan ortam değişimlerinden kaçınma gerekliliği ile sınırlıdır; gerektiğinde dikkatli yarı-ortam değişim tekniklerinin uygulanmasını gerektirir.
