建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

本实验的总体目标是建立一种高度可重复的大鼠血脑屏障体外模型。该模型的制备首先在体视显微镜下剔除视神经、小脑和脑膜，随后分离两个大脑半球并进行解剖，以获得干净的皮层组织。第二步是通过酶消化处理及基于密度的离心法，从皮层组织中分离出微血管。

接下来，将微血管接种并用嘌呤霉素孵育，以去除寄生虫等污染细胞，从而纯化内皮细胞。纯化的脑微血管内皮细胞持续增殖，直至细胞汇合度达到90%。最后一步是通过将细胞接种于插入式滤膜的上室，并与先前制备并接种的大鼠星形胶质细胞共培养，诱导大鼠脑内皮细胞分化。

最终，可通过特定紧密连接蛋白的表达以及参考化合物从上室穿过内皮细胞单层的通透性指数来表征已分化的脑微血管内皮细胞单层。体外血脑屏障模型（例如本文所述模型）有助于研究关键分子的细胞分布，并揭示血脑屏障功能的基本细胞与分子机制。特别是，此类模型可使我们深入探究血脑屏障受体及其在内吞运输和转胞吞作用中的参与情况。

体外血脑屏障（BBB）模型主要用于研究我们开发的肽类载体对特定受体的靶向作用。为了促进药物经血脑屏障向中枢神经系统（CNS）递送，我们采用一种称为受体介导的转胞吞作用（receptor mediated transcytosis）的方法，也被称为“特洛伊木马”策略。直观的可视化描述至关重要，因为初次接触该方法的研究人员需要具备解剖技能，并需借助显微镜快速而准确地操作，以确保细胞制备过程中组织的存活率。

另一个关键点是过早终止脆弱区域以及远端鲑鱼区域，以避免在实验过程中屏障打开。最后，这一思路将展示该方案中的具体细节，这些细节将区分红色标记与可视化方案，从而证明该操作由本人及同事完成。开始此操作时，用 IV 型胶原和纤连蛋白在无菌培养用水中以每平方厘米 1 微克的浓度包被两个 T75 培养瓶，并将其置于 37°C 培养箱中孵育，直至进行微血管接种。

两天后，取出三只五周龄Vista大鼠颅腔内的脑组织，转移至盛有冰上预冷的解剖缓冲液的培养皿中。在解剖显微镜下分离脑组织，去除小脑和视神经。随后在体视显微镜下将每侧脑组织沿中线切开，分离左右两个大脑半球。

用另一刀切口去除中脑，并将全部四个脑组织转移至冰上装有解剖缓冲液的干净培养皿中。随后，将其中一个前脑转移至盛有冷解剖缓冲液的新培养皿中，用镊子固定，小心地从前脑边缘剥离脑膜。

随后，将前脑翻转，小心地剥离脑膜，避免撕裂。确保前脑完全清除脑膜，并切断残留的视神经部分。此步骤的目的是去除白质层，从而获得一层皮层组织。

首先在前脑边缘处用镊子夹住，然后小心地沿表面拖动镊子，注意不要撕破皮层表面。接着将脑组织翻转，检查是否已完全去除脑膜，确保无残留脑膜或较大的表面血管。接下来，从颅骨中取出三只脑组织后，整个解剖过程应控制在两小时以内，以保证组织的保存质量和细胞存活率。

将三只大脑的皮层转移至7毫升下部匀浆器中的6毫升冷解剖缓冲液中，随后使用较大间隙的首个研杵进行10次上下研磨，再使用较小间隙的第二个研杵进行10次上下研磨，以解离皮层组织。然后将6毫升细胞悬液转移至一个新的50毫升Falcon管中，并用24毫升冷解剖缓冲液冲洗下部匀浆器，将悬液分装至三个Falcon管中，使每管含有相当于一个皮层的组织量。随后，在室温下以1000 ×g离心5分钟。

观察沉淀物可见粉红色梯度，代表皮层的微血管部分。弃去上清液，将一个皮层的沉淀物与含有胶原酶混合液（collagenases dyse、DNA酶I型）及庆大霉素的1毫升酶解溶液进行匀浆。将试管置于37摄氏度摇床中孵育30分钟。

然后将1毫升消化液与10毫升25% B-S-A-H-B-S-S 1×混合，轻轻涡旋混匀后，在室温下以3,600 G离心15分钟，进行密度梯度离心分离。密度梯度离心后，沉淀物中含有微血管，而上层漂浮物包含髓鞘、脑实质及残留的微血管。小心地将上层漂浮物和上清液转移至干净的50毫升Falcon管中。

注意不要吸出微血管沉淀，轻轻涡旋试管，并在第二次离心过程中重复密度梯度离心。将含有微血管的最终沉淀置于 4 摄氏度保存。在第二次密度梯度离心后，小心弃去上层圆盘和 snat 混合物，并用 1 毫升冰冷的 HBSS 1× 将两次离心所得的含有微血管的沉淀重新悬浮。

接着，用20毫升冰冷的1×HBSS缓冲液洗涤微血管，并在1000 ×g条件下离心5分钟。然后弃去上清液，注意不要丢失微血管。取一个皮质组织来源的微血管沉淀，加入1毫升相同的酶解溶液，轻轻涡旋混匀试管，使沉淀充分匀浆。

将微血管在37摄氏度下于摇床中继续消化一小时。随后，将来自三个皮层的已消化微血管混合至一个离心管中。再次将混合物分装至两个50毫升的Falcon离心管中，使每管含有相当于一个半皮层的微血管。

然后在室温下，以1000 G离心五分钟。在铺板微血管之前，从培养箱中取出两个已包被的T75培养瓶，吸除多余的包被液。弃去上清液，将微血管沉淀物重悬于1毫升ECM中，并用补充有4微克/毫升的ECM将每管定容至10毫升。

使用嘌呤霉素开始纯化过程，并将微血管接种于培养瓶中。随后将培养瓶置于37°C、5% CO2的培养箱中，使微血管黏附于胶原-纤连蛋白基质，以继续进行纯化。微血管接种后24小时，用新鲜的ECM洗涤细胞碎片，并将培养基更换为添加4 μg/mL嘌呤霉素的ECM，继续在37°C、5% CO2培养箱中培养至第5天。微血管接种后24小时，内皮细胞开始在胶原-纤连蛋白基质上迁移并铺展。至第5天完成纯化过程时，用新鲜的ECM洗涤细胞碎片，并将培养基更换为添加2 μg/mL嘌呤霉素的ECM。

为促进增殖，继续使用嘌呤霉素处理三天。第8天时，洗涤细胞并添加胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。从此时起持续补充至培养基中，直至培养物在第10天达到90%融合度。

第8天，通过在无菌培养用水中加入终浓度均为每平方厘米0.5微克的胶原IV型和纤连蛋白混合液，对三个12孔板的滤膜进行包被处理。首先，在下室加入1.5毫升无菌培养用水。

然后向上面的隔室中加入0.5毫升混合液。在37摄氏度下孵育，使基质黏附，直至同一天接种内皮细胞，即在共培养建立前五天。在37摄氏度下从冻存管中解冻星形胶质细胞，并将细胞转移至含有10毫升GCM的15毫升离心管中，进行离心。

在室温下以120 ×g离心八分钟。然后将星形胶质细胞沉淀重悬于GCM中，并以每平方厘米30,000个细胞的密度接种。在第10天，于使用胰蛋白酶解离RBEC之前，将12孔板放入37°C、5% CO2的培养箱中。

用 DMM F 12 培养基清洗预编码滤膜，用 ECM 预填充小室，并将其放回培养箱，待同日进行 RBEC 接种。用不含钙和镁的 DPBS 清洗 RBEC 两次。每瓶 T 75 培养瓶加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的胰蛋白酶 EDTA 溶液，作用 exactly 30 秒后，移除 3.5 毫升胰蛋白酶 EDTA 溶液。

确保胰蛋白酶EDTA始终覆盖内皮细胞层。随后在显微镜下观察细胞脱落情况。当细胞层开始从基质上脱离时，轻轻敲击T75培养瓶边缘，直至所有细胞悬浮。

向每个T 75培养瓶中加入3毫升ECM，并转移至50毫升离心管中。重复此步骤两次，通过冲洗培养基以收集全部细胞。

用带黄色枪头的10毫升移液器将细胞悬液轻轻吹打4次，使细胞充分分散。计数悬液中的细胞，并于次日将细胞以高密度接种至预先编码并加好培养基的滤膜上。更换上室培养基两次，以去除细胞碎片，避免在换液过程中破坏细胞单层。

轻微倾斜培养板，且吸液时切勿触及细胞单层，始终保留部分培养基覆盖于细胞单层上方，以避免换液过程中细胞单层干燥。每次仅洗涤六个插入式培养小室。接种后24小时，细胞单层需达到融合状态。

然后在同一天，即共培养建立前的一天，在第12天用1.5毫升添加了补充剂的分化培养基替换星形胶质细胞的培养基，该时间点定义为分化的第一天。将含有RBEC的滤膜中的培养基更换为分化培养基。随后，在此条件下，将RBEC滤膜转移至含有星形胶质细胞的孔中。

体外模型在三天内即可分化并表达连接相关蛋白，最佳分化状态可持续再维持三天。此处的细胞单层经免疫染色以显示汇合的脑微血管内皮细胞单层，呈现无重叠的形态特征以及典型的内皮细胞纺锤形形态，同时表达紧密连接蛋白ZO-1和occludin。12孔板中血脑屏障模型的紧密性通过检测荧光黄的转运来评估。

结果以通透性或通透系数（PE）表示，单位为10⁻³厘米/分钟，当荧光素钠（LY）的PE值超过0.6 × 10⁻³厘米/分钟时，认为屏障具有通透性或处于开放状态。在过去几十年中，大量出版物和综述提供了来自不同物种的静态和动态体外血脑屏障（BBB）模型的相关信息。然而，这些模型仍然难以操作，屏障质量的可重复性仍是亟待解决的主要目标之一。

观看本视频后，科研人员应能充分掌握如何构建和表征体外血脑屏障模型的方法。