مزيج من Microstereolithography وElectrospinning لإنتاج أغشية مجهزة الكوات لتجديد القرنية

الهدف العام من التجربة التالية هو إدخال التعقيد المكاني ثلاثي الأبعاد داخل سقالات هندسة الأنسجة من خلال الجمع بين استخدام تقنيات التصنيع المضافة والغزل الكهربائي. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء قالب غير قابل للتحلل مصنوع من البولي إيثيلين جلايكول أو D acrl أو PEG DA ، باستخدام تقنية معالجة الصور طبقة تلو الأخرى تسمى الطباعة الحجرية المجسمة الدقيقة. كخطوة ثانية.

يتم إرفاق القوالب بركيزة معدنية ويتم استخدام الغزل الكهربائي لإنتاج غشاء قابل للتحلل الحيوي يحاكي التشكل الأساسي. بعد ذلك ، تتم دراسة إجراءات التعبئة وتدهور الأغشية المغزولة الكهربائية. يتم تجنب التدهور المبكر للأغشية المخزنة عن طريق التحكم في درجة الحرارة والرطوبة.

تتكون الخطوة الأخيرة من وضع الأغشية القابلة للتحلل على نموذج القرنية المصابة ثلاثية الأبعاد لدراسة استخدامها المحتمل كأجهزة لتجديد القرنية. تظهر النتائج تعدد استخدامات استخدام تقنيات التصنيع المضافة والغزل الكهربائي لإنشاء أغشية معقدة تحتوي على جيوب صغيرة تحاكي إلى حد ما مكانة الخلايا الجذعية الطبيعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تعدد استخداماتها.

نظرا لأنه يمكن إنشاء قوالب غير قابلة للتحلل الحيوي جديدة ، باستخدام مجموعة واسعة من تقنيات التصنيع ، فإن هذه الطريقة ستكون ذات أهمية في كل من مجالات التصنيع وتجديد الأنسجة ، وستساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بسلوك الخلايا الجذعية ومكانة الخلايا الجذعية. يمكن أن توفر طريقة صنع السقالات الدقيقة نظرة ثاقبة لتجديد القرنية. يمكن أيضا تطبيقه على الأنسجة الظهارية الأخرى ذات منافذ الخلايا الجذعية مثل الجلد والغشاء المخاطي للفم ، أو لتوفير ميزات وسقالات ثلاثية الأبعاد أخرى لهندسة مجموعة واسعة من الأنسجة.

سيقوم كل من الزعيم أورتيجا وتوماس باترسون بعرض الإجراء. ابدأ هذا الإجراء بإنشاء L واحد ، الطبقة الأولى. سيصبح ذلك قاعدة الهيكل باستخدام أي برنامج رسم مناسب لدائرة سوداء 1.2 سم.

بعد ذلك ، قم بإنشاء L اثنين. الطبقة الثانية ، ترسم دائرة سوداء أخرى بطول 1.2 سم ، ولكنها تتضمن ستة إلى ثمانية هياكل بيضاء على شكل حدوة حصان 0.5 × 0.35 ملم. وزعي أشكال حدوة الحصان البيضاء الصغيرة داخل هيكل الدائرة السوداء.

احفظ L واحد و L اثنين بتنسيق JPEG لإعداد الطباعة الحجرية المجسمة الدقيقة. أولا ، قم بضبط بصريات النظام وتنظيفها بعناية. ضع 300 ميكرولتر من البولي إيثيلين جلايكول دي أكرل ، أو خليط PEG D في بئر من لوحة زراعة الأنسجة 12 جيدا.

يجب أن يكون البئر مطلي مسبقا بالتفلون أو مادة أخرى غير لاصقة أو سهولة إزالة الهيكل. بعد المعالجة ، قم بتشغيل الليزر الأزرق وقم بتحميل L one في ALP ثلاثة برامج أساسية. هذا البرنامج عبارة عن واجهة USP توفر الرابط بين الكمبيوتر وجهاز المرآة الصغيرة الرقمية.

تشعيع الطبقة الأولى لمدة 60 ثانية. أضف إلى البئر 250 ميكرولتر أكثر من الوتد دا. قم بتحميل L اثنين وقم بإشعاع L اثنين لمدة 60 ثانية.

قم بإزالة البوليمر غير المعالج واغسل الحلقات بالأيزوبروبانول طوال الليل في اليوم السابق للغزل الكهربائي ، قم بإنشاء مجمع غزل كهربائي ثابت عن طريق توزيع حلقات PEG DA على صفائح ألمنيوم مطلية بالكهرباء 12 سم × 20 سم. قم بتوصيل الحلقات باستخدام شريط كربون موصل. تحضير محلول بولي لاكتيد كو جليكو أو PLGA وحركه طوال الليل قبل استخدامه في اليوم التالي.

ضع أربع محاقن سعة خمسة ملليلتر بإبر بقطر داخلي حاد 0.8 سم على مضخة حقنة. يتم استخدام أربع محاقن بدلا من حقنة واحدة. لضمان تحميل الغزل الكهربائي بسرعة 2.5 مل من محلول PLGA في كل حقنة.

لنجاح هذا الإجراء ، من المهم محاولة الحفاظ على متغيرات الصنوبر اللارو ثابتة قدر الإمكان. اترك مسافة بين الإبر والمجمع 15 سم. اضبط معدل تدفق 30 ميكرولتر في الدقيقة والجهد الكهربائي الذي يتراوح من 12 إلى 15 كيلو فولت للدوران الكهربائي لمدة ساعة و 30 دقيقة.

عند الانتهاء من الغزل الكهربائي ، قم بتقشير ورقة الإسفنج الكهربائي PLGA بعناية من المجمع الذي يدعم حلقات PEG da. يمكن إعادة استخدام حلقات PEG DA كقوالب للغزل الكهربائي. استخدم ثقب دائري لقطع السقالات الكهربائية إلى دوائر قطرها 22 ملم.

ترك هيكل الحلقة في المنتصف لإعداد أغشية PLGA للتخزين طويل الأجل. قم بتركيب كل منها في وعاء صغير مثل طبق بتري بلاستيكي وضعه داخل كيس طبي. ضع ثلاثة أكياس من المجفف داخل كيس الدرجة الطبية.

أضف إلى الحقيبة بطاقة مؤشر رطوبة سداسية النقاط المتوفرة تجاريا. سيكتشف هذا أي تراكم للرطوبة خلال فترة التخزين. استخدم آلة ختم الحرارة بالفراغ لتنظيف الكيس بالمكنسة الكهربائية وإغلاقها.

بعد ذلك ، يتم إرسال أغشية PLGA إلى شركة خارجية ، جاما أو الإشعاع قبل التخزين. في هذه التجربة ، يتم عزل الباذنجان القزحي للأرانب عن عيون الأرانب التي تم الحصول عليها من مزرعة حيث يتم تربية الأرانب للاستهلاك. قم أولا بتطهير عيون الأرانب باستخدام محلول مطهر 3٪.

بعد ذلك ، نظف العينين عن طريق إزالة أي أنسجة زائدة تحيط بالقرنية. يمكن تحديد المنطقة الداكنة على أنها منطقة دائرية رقيقة بين القرنية الشفافة والصلبة البيضاء. افصل المنطقة القزحية عن بقية القرنية.

قطع المنطقة الداكنة إلى أجزاء يبلغ طولها حوالي 1.5 سم ، وتطهير الأجزاء الداكنة الطرفية في محلول مطهر بنسبة 1.5٪ لمدة دقيقة واحدة. بعد التطهير ، استخدم شفرة مشرط لتقطيع الأجزاء الداكنة إلى قطع صغيرة. قم بتخزين القطع الصغيرة من المناديل في DMEM بالإضافة إلى وسائط التخمين القصوى عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون أو بحد أقصى ساعة واحدة قبل الاستخدام.

لبدء هذا الإجراء ، استخدم مكشطة خلية لتغطية الأغشية الحلقية ب 15 ميكرولترا من غراء الفيبريلين. وزعي الليفية بالتساوي أثناء العمل تحت مجهر تشريح. استخدم إبرة قياس 25 لوضع النباتات الداكنة القزحية مباشرة على جيوب PLGA الصغيرة.

ضع الحلقات مع الأنسجة على القرنيات المجردة مسبقا. مع مواجهة explan لأعلى وفي ظروف واجهة سائل الهواء ، سوف تبلل حلقة PLGA بسرعة وتعتمد شكل نموذج القرنية. الحفاظ على نماذج زراعة الأعضاء لمدة أربعة أسابيع في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون تغيير الوسائط كل يومين.

تتيح الطباعة الحجرية المجسمة الدقيقة تصنيع حلقات PEG DA بأحجام مختلفة والدمج المتزامن للميزات الدقيقة. يمكن تصنيع الحلقات وإعادة استخدامها بشكل متكرر ويمكن توصيلها بسهولة بصفائح معدنية يمكن استخدامها كمجمع غزل كهربائي. في هذا المثال، تحتوي الحلقات على ميزات دقيقة لحوة الحصان.

ينتج الغزل الكهربائي نسخا متماثلة من PLGA ، وتعبئة فراغ أغشية PLGA يحسن بشكل كبير تخزينها على المدى الطويل حتى عند 37 درجة مئوية في ظروف رطبة متعمدة. يؤثر نوع الكيس المستخدم أيضا على استقرار الغشاء ، ويظهر الفحص المجهري الإلكتروني الماسح وفحص الأجزاء الثلاثة أي تغييرات في سلامة الألياف أو رطوبة الألياف السليمة. نمو الخلايا من الغرسات القزحية أو مدعومة بكل من حلقات وحلقات PLGA القابلة للتحلل الحيوي المصنوعة حديثا بعد ستة أشهر من التخزين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

عند وضع أغشية PLGA على نماذج القرنية المصابة ثلاثية الأبعاد ، تم تحقيق نقل الخلايا بعد أربعة أسابيع. تظهر الصور H و e الظهارة الجديدة متعددة الطبقات التي تشكلت من الخلايا الخارجة من النباتات الخارجية الموضوعة على المنافذ. أكدت السيطرة السلبية عدم تكوين ظهارة جديدة في غياب أي خلايا مضافة.

بالمقارنة مع ظهارة القرنية التقليدية التي لوحظت في قرنية الأرانب الطازجة المستخدمة كعنصر تحكم إيجابي. أظهرت كيمياء السيتو المناعية أن الخلايا التي تنمو من الغرسات كانت خلايا ظهارية للقرنية لأنها كانت إيجابية للسيتوكيراتين ثلاثة ، وهي علامة تمايز القرنية. نظرا لأن مجمعات الغزل الكهربائي التي تحتوي على القوالب غير القابلة للتحلل الحيوي قابلة لإعادة الاستخدام ، يمكن إنتاج السقالات في غضون ساعتين عندما يتم تحسين البروتوكول.

تسمح هذه التقنية للباحثين في مجالات هندسة الأنسجة باستكشاف طريقة جديدة لتصنيع أغشية هندسة الأنسجة المعقدة التي تحتوي على ميزات دقيقة لدراسة سلوك الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء قالب صغير غير قابل للتحلل باستخدام تقنيات التصنيع المضافة أو الأساليب المماثلة مثل النمذجة وكيفية استخدام الغزل الكهربائي لإضافة تعقيد إلى السقالات الخاصة بك.