生物発光イメージングが続くマウス皮下モデルにおける医学関連の異物にカンジダ·アルビカンスバイオフィルム発展

次の実験の全体的な目標は、カンジダアルビカン細胞によるin vivoバイオフィルム形成の非侵襲的モニタリングのためのルシフェラーゼ発現株の使用を検証することです。これは、カンジダ・アルビカンスの株を発現するルシフェラーゼがコロニーを形成したカテーテル断片をマウスの背部に移植することによって達成されます。第2ステップでは、酵母は細胞外マトリックス内に埋め込まれた細胞の厚い層に成長させられ、カテーテルの内側に成熟したバイオフィルムを生成します。

次に、ルシフェラーゼ酵素によって変換される基質が添加されます。この反応により、測定可能な光が生成されます 生物発光イメージングまたはBLIは、次に、生きている宿主内のバイオフィルムの形成を記録および定量化するために使用されます。この技術が他の既存の技術(中央Venmoシステムなど)と比較した場合の主な利点は、1匹の動物内で最大6つのバイオフィルムを試験できるため、統計分析に必要な動物の数を大幅に減らすことができることです。

この技術の意味は、私たちの方法が既存および新規の抗真菌成分の簡単なテストを可能にするため、カンジダアルビカンスのバイオフィルム形成の治療にまで及びます。また、この方法は、カンジダ・アルビカンス、真菌のバイオフィルムについての洞察を提供することができます。また、バクテリアや他の楽しい種などの他の微生物にも適用できます。

提案された手順は、外科的処置の24時間前に動物施設にアクセスできる任意の実験室で簡単に実装できます 生物学的安全キャビネット内のトリプルルーメンカテーテルを含むパッケージを開ける。滅菌ピンセットを使用して不要な部分をすべて取り外し、滅菌メスを使用してカテーテルに取り付けられている部分を切断します。次に、プラスチックパッケージの下に定規を置き、ポリウレタンカテーテルを1センチメートルの長さにカットします。

次に、各カテーテルに約1.8ミリリットルの100%胎児ウシ血清を充填し、37°Cで一晩インキュベートします。翌朝、各血清コーティングカテーテル片を個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、YPDプレートのCアルビカンスを1〜100希釈の別のマイクロ遠心チューブで1ミリリットルのPBSにこすり落とします。カウント後、細胞懸濁液を1ミリリットルあたり4番目の細胞の10の5倍の最終濃度に希釈します。

そして、血清コーティングされたカテーテル片のそれぞれに1ミリリットルの細胞を追加します。細胞を摂氏37度で90分間カテーテルに接着させます。次に、滅菌ピンセットでチューブを垂直位置に保持します。

各ピースをルーメンに2回、1ミリリットルのPBSで優しく洗い流して、カテーテルを配置します。温熱パッドに配置された生後8週間の雌の麻酔マウスの腰を剃ることから始めます。次に、皮膚を消毒し、動物の両側に0.5〜1センチメートルの小さな切開を1回行います。

次に、ハサミでサブキュを解剖し、長さ約1.5センチ、幅約1センチの2つの皮下トンネルを作成します。各トンネルに3つのカテーテルピースを挿入し、ピースが重ならないように水平に並んでいることを確認します。縫合糸で切開部を閉じてから、消毒剤で傷口を非常に優しく洗浄します。

次に、切開部に直接局所麻酔薬を塗布し、動物が完全に回復するまで動物を監視する麻酔逆転剤を投与します。適切な実験時点でのバイオフィルム形成を画像化するには、麻酔をかけた動物のカテーテルを含む各領域に、新たに調製したコイルとテレジンを100マイクロリットルの皮下注射します。次に、最大信号強度に達するまで、20秒から60秒の範囲の収集時間で連続スキャンを取得します。

次のフレームの取得中に、カテーテルの各トリオに関心領域を配置して、以前に取得したフレームの生物発光イメージングまたはBLI信号強度を測定します。固定サイズの長方形の関心領域を制御領域にも配置して、リビングイメージソフトウェアで背景信号を測定します。各カテーテルトリオの関心領域と背景の関心領域を通る光子束を測定します。

バイオフィルム形成中にすべての動物および異なる時点でこれらの測定を繰り返した後、各カテーテルトリオのBLI信号強度は、毎秒の光子束として報告されます。データは、スプレッドシートプログラムに直接コピーして貼り付けることができます。縦断的実験の最後に、皮下組織を切開した各動物を犠牲にし、滅菌ピンセットを使用してカテーテル片を1つずつ除去します。

先ほど示したように、1ミリリットルのPBSでカテーテルを2回洗浄します。次に、新しいマイクロ遠心分離チューブで、水浴中で40, 000ヘルツの新鮮なPBSの1ミリリットルでピースを超音波処理します。10分後に超音波処理し、カテーテルを含むチューブを氷上に配置し、元のサンプルの100マイクロリットルをYPD寒天プレート上に1〜100希釈でプレートします。

重複して。最後に、コロニー形成単位の平均と標準偏差をプロットします。そして、対数スケールでの各動物のBLI信号。

この画像では、バイオフィルム現像の6日後に示される関心領域とともに生物発光シグナルを示す代表的な動物が示されています。コントロールバックグラウンド領域にシグナル伝達が欠如していることに注目し、バイオフィルムがカンジダコーティングカテーテルのすぐ隣接する領域に限定されていることを裏付けています。この代表的な実験では、ビオフィルムを発現するルシフェラーゼが産生する明瞭なBLIシグナルが観察されるのに対し、野生型株はバックグラウンドシグナルしか産生されないように見えます。

このシグナルの増加は、バイオフィルムあたりのコロニー形成単位の増加と、動物の各グループの光子束測定と同じ傾向に従います。これらのデータは、BLIが皮下マウスモデルにおけるin vivo成熟Cアルビカンスバイオフィルム形成をモニタリングおよび定量するための強力な技術であることを示しています。カンジダ細胞によるデバイスの感染をマスターすると、2時間かかる場合がありますが、カテーテルインプラントはマウス1匹あたり10分で完了します。

BLIイメージングは、マウス1匹あたり5分で行うことができます。BLIを使用する大きな利点は、同じ動物でバイオマスとバイオフィルムの発達を繰り返し監視できることです。時間の経過とともに この手順に続いて、MRIやCTなどの他の方法で、正確な大聖堂の位置に関する情報を提供できます。

この情報は、深部静脈カテドラルモデルのようなより複雑なモデルでの定量化に使用できます。このビデオを見た後、マウスでin vivo、皮下バイオフィルム、ssを実行する方法について非常によく理解しているはずであり、これは宿主病原体の相互作用のさらに詳細な分析の基礎を形成する可能性があります。