قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط الخلايا التائية باستخدام قياس تدفق التصوير. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم المناعة المزروعة، مثل نسبة الخلايا التائية للمتلقي التي تتفاعل مع المستضدات الخيفية للمتبرع. تجمع هذه التقنية بين القوى الكمية متعددة العوامل لقياس التدفق الخلوي مع قدرات التصوير للفحص المجهري الفلوري للسماح بالفحص عالي الإنتاجية لمستضد الخلايا التائية الفردي الذي يقدم نقاط الاشتباك العصبي للخلايا.

سيوضح الإجراء سجاد موشكلقوشا ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ بزرع نقطة الصفر خمس في 10 إلى الخلايا التغصنية السادسة. في كل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا ، متبوعا بمرة واحدة في 10 إلى الخلايا التائية السادسة ، وحجم نهائي يصل إلى 50 ميكرولتر من وسط الثقافة لكل بئر.

احتضان المزارع الباردة لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. ثم أضف ثلاثة أضعاف حجم المزرعة البالغ نقطة وخمسة بالمائة من الفورمالديهايد في PBS إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية التثبيت ، انقل الخلايا من كل بئر إلى أنبوب بوليسترين خمسة ملليلتر.

قم بتلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة المناسبة بالفلوروكروم في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. بعد ذلك ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من محلول الغسيل وأعد تعليق الكريات في محلول تجعيد / غسيل يحتوي على الفالودين FITC. بعد 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من التجعيد / الغسيل الطازج.

أعد تعليق الكريات في الصبغة النووية ذات الأهمية في التجعيد / الغسيل المؤقت لمدة 30 دقيقة حضانة أخيرة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. اغسل الخلايا في ملليمتر واحد من التجعيد / الغسيل المتبوعا بغسل واحد في مخزن الغسيل وحده. ثم أعد تعليق الخلايا في 50 إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل الطازج.

نقل الخلايا إلى أنابيب صغيرة مغطاة بأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. لتحليل التفاعلات من خلية إلى خلية ، احتفظ أولا بقناة واحدة للحصول على صورة المجال الساطع وقم بتحميل أنبوب التحكم الأول. مع إيقاف تشغيل قناة المجال الساطع، في نافذة مساحة العمل، قم بإنشاء مخطط مبعثر جديد لكل قناة مستخدمة مع نسبة العرض إلى الارتفاع فوق المنطقة.

قم بابتداء المفردات حيث تكون نسبة العرض إلى الارتفاع قريبة من واحد. لكل فلوروكروم ، تحقق من المجموعة الموجبة واضبط جهد الليزر في صندوق الإضاءة ، حسب الضرورة. في مربع القنوات ، حدد القنوات المناسبة للفلوروكروم المستخدم في التلوين.

ثم انقر فوق تسجيل. عندما يصل عدد الأحداث إلى الحد المحدد، سيتوقف الاكتساب تلقائيا. بعد الحصول على جميع عناصر التحكم في البقعة الفردية ، قم بتحميل أول أنبوب عينة تجريبي واحصل على عشرات الآلاف من الأحداث تحت قنوات التحليل المناسبة ، بما في ذلك قناة المجال الساطع.

لإنشاء مصفوفة تعويض ، قم بتحميل ملفات بيانات التحكم في البقعة الفردية في معالج التعويض وحدد قنوات الفلورسنت المناسبة للتجربة. بعد التأكد من تحديد المجموعات الموجبة الصحيحة، انقر نقرا مزدوجا فوق قيمة في المصفوفة وأضف الرسم البياني إلى منطقة التحليل لكل قناة. انقر فوق إنهاء لحفظ مصفوفة التعويض كملف CTM.

قم بتحميل ملف RIF في برنامج التحليل المناسب. قم بتحويل ملف RIF إلى ملف DAF لتحليل البيانات. افتح نموذج الملف الأول.

ارسم متوسط جذر المربع لمعدل تغير شدة التصوير في قناة المجال الساطع. بعد ذلك ، ارسم نسبة العرض إلى الارتفاع مقابل منطقة علامة الخلية العارضة للمستضد. قم بتثبيت الزوجات التي تحتوي على خلية واحدة تقدم مستضد.

ارسم نسبة العرض إلى الارتفاع مقابل مساحة علامة الخلية التائية. قم بالدخول على الزوجات التي تحتوي على خلية T واحدة. لتحديد الخلايا الملامسة لبعضها البعض، ضمن قائمة التحليل، استخدم خيار الأقنعة لفتح مدير الأقنعة، وقم بتسمية قناع كائن الخلية التائية للقناع الجديد.

انقر فوق زر الوظيفة وفي مربع الحوار ، حدد الكائن. حدد القناة التي تم اكتشاف علامة الخلية T فيها وانقر فوق موافق. قم بإنشاء قناع لعلامة الخلية العارضة للمستضد في القناة المناسبة بنفس الطريقة. ارسم شدة مضان علامة الخلية التائية في قناع كائن الخلية المقدم للمستضد مقابل شدة مضان الخلية العارضة للمستضد في قناع كائن الخلية التائية.

ثم ارسم بوابة تتضمن فقط الخلايا الملامسة لبعضها البعض. أخيرا ، راجع يدويا صور phalloidin FITC للأحداث داخل هذه البوابة لتمييز نقاط الاشتباك العصبي المناعية الناضجة عن جهات الاتصال البسيطة من خلية إلى خلية باستخدام وظيفة صور العلامة لتمييز هذه الصور. هنا ، تظهر بوابة التلامس الغشائية للخلايا التائية الإيجابية CD4 الطحالية التي تم الحصول عليها من متلقين متحملين وغير متحملين للطعوم الخيفية القلبية B6 بعد سبعة أيام من الزرع وتزامن مع الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم B6 ، كما هو موضح.

مع الأحداث المشبكية وغير المشبكية المشار إليها من خلال الشعيرات المتصالبة الخضراء. تسمح تحليلات قناة بريجفيلد والفلورسنت أيضا بتصور الأحداث المشبكية وغير المشبكية الفردية. في الواقع ، يمكن تمييز نقاط الاشتباك العصبي من كل من متلقي CDA غير المتسامح معهم والمتسامح معهم لقلوب B6 بسهولة عن جهات الاتصال غير المشبكية من خلال وجود حواف إيجابية كثيفة ل FITC في واجهة الخلية العارضة لمستضد الخلية التائية.

بعد مزيد من التطوير ، قد تكون هذه التقنية قابلة للتطبيق في البيئات السريرية ، مثل تقليل أو سحب تثبيط المناعة أو التنبؤ بنتيجة الكسب غير المشروع في متلقي الترانس بانت البشري.