Name: Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer de radioactieve pulse-chase methode met 35S-gelabelde methionine en cysteïne om eiwitbiosynthese, vouwing en afbraak in levende cellen te analyseren. Dit protocol biedt een kwantitatieve assay voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken alle leden van de Braakman lab, verleden en presenteren, voor hun vruchtbare discussies en helpen bij de ontwikkeling van de methoden in dit artikel wordt gepresenteerd. Dit project heeft financiering ontvangen van zowel de Europese Onderzoeksraad onder de Europese Unie zevendekaderprogramma (KP7/2007-2013) N ° 235649 en de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) onder het ECHO-programma N ° 711.012.008.

Alle radioactieve reagentia en procedures werden behandeld in overeenstemming met lokale Universiteit Utrecht straling regels en voorschriften.
1. pulse Chase
<ol><li>
Pulse Chase voor Adherente cellen Opmerking: De hier gegeven volumes zijn gebaseerd op 60 mm cel cultuur gerechten. Voor 35 mm of 100 mm gerechten, vermenigvuldigt u de volumes met 1/2 of 2, respectievelijk. Dit protocol maakt gebruik van een puls-tijd van 10 min en chase tijden van 0, 15, 30, 60, 120 en 240 min. Dit kunnen variëren afhankelijk van de specifieke proteïnen bestudeerd (zie hieronder).<ol>
<li>Zaad van Adherente cellen (bijvoorbeeldHEK 293, HeLa, CHO) in zes 60 mm cel cultuur gerechten, zodat zij zullen subconfluent (80% - 90%) op de dag van de puls-jacht. Het gebruik van ten minste één schotel per tijdstip en/of voorwaarde.</li>
		<li>Indien nodig, transfect de cellen met verkrijgbare transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant; of, viraal transduce8 de cellen 1 dag vóór de puls-chase met de juiste constructie voor expressie experiment.</li>
		<li>De afwas met 2 mL was buffer (Henks uitgebalanceerd zoutoplossing [HBSS]), voeg 2 mL van honger medium (normale kweekmedium ontbreekt van methionine en cysteïne en foetale runderserum [FBS], zoals minimale essentiële medium [MEM] zonder methionine en cysteïne maar met 10 mM HEPES, pH 7.4), en plaats de schotels in een bevochtigde incubator van de 37 ° C met 5% CO2 gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Overbrengen in de gerechten de rekken in een waterbad 37 ° C voorverwarmde dus dat ze in contact met water maar niet doen drijven. Een timer te starten.</li>
		<li>Bij 40 s, gecombineerd het medium van de honger, 600 µL van pulse oplossing (honger media + 55 µCi/35 mm schotel label, zie de opmerking voorafgaand aan stap 1.1.1) opstellen in de pipet, en toe te voegen zachtjes naar het midden van de schotel op precies 1 min. Herhaal deze stap voor t tussenpozen 1 min Hij resterende gerechten. Begin met het langste achtervolging monster om tijd tijdens uw experiment te besparen. Opmerking: Bij het verwerken van radioactief materiaal, is het essentieel te volgen passende voorzorgsmaatregelen en lokale regels en voorschriften ter voorkoming van accidentele blootstelling en/of besmetting.</li>
		<li>Op precies 11 min voor alle volgende gerechten, met uitzondering van het 0 min chase monster, voeg toe 2 mL van chase medium rechtstreeks naar de schotel, gecombineerd het en opnieuw, voeg 2 mL van chase medium. Herhaal deze stap voor de overige gerechten tussenpozen 1 min. Alle gerechten overbrengen in een 37 ° C incubator.</li>
		<li>Op precies 16 minuten, voeg 2 mL van chase medium (normale kweekmedium + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM cysteïne en methionine 5 mM) rechtstreeks naar de 0 min monster schotel op de top van het medium van de pols om te stoppen met etikettering; vervolgens onmiddellijk gecombineerd, de schotel overbrengen in een gekoelde aluminiumplaat, en voeg 2 mL ijskoud stop buffer (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]). Opmerking: Dit is de 0 min chase steekproef. Voor dit voorbeeld, ga direct naar stap 1.1.9.</li>
		<li>Elk gerecht chase ook terug overzetten naar het waterbad 2 min voordat chase telkens (bijvoorbeeld24 min. voor een achtervolging van 15 min) en, op het moment van de exacte chase (bijvoorbeeld26 min. voor een achtervolging van 15 min), gecombineerd de chase-media (of het overbrengen van een microcentrifuge buis als volgende pr de secretie van de otein) en de schotel overbrengen in een gekoelde aluminiumplaat. Voeg toe 2 mL ijskoud stop buffer.</li>
		<li>Incubeer alle gerechten op ijs in de stop-buffer voor ≥5 min; vervolgens de eindeoplossing gecombineerd en wassen met 2 mL ijskoud eindeoplossing. De wash gecombineerd en gerechten met 600 µL van lysis buffer lyse (met fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] + nondenaturing wasmiddel [Zie Tabel of Materials] proteaseinhibitors + 20 mM NEM). Gebruik een cel schraper om ervoor te zorgen dat de gerechten kwantitatief zijn lysed.</li>
		<li>Overdracht van de lysate een tube van 1,5 mL microcentrifuge en centrifuge voor 10 min bij 15,000-20,000 x g en 4 ° C tot pellet de kernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pulse Chase voor schorsing cellen Opmerking: Om ervoor te zorgen efficiënte etikettering, cellen moeten worden gepulseerde bij een concentratie van 3 x 10,6 tot en met 5 x 106 cellen/mL, en chase volumes moet 4 x het volume van de pols. In het volgende voorbeeld, gepulseerde wij 5 x 106 cellen in een volume van 1 mL voor 10 min, aan opbrengst vijf achter de tijd aanhollen wijst (0, 15, 30, 60 en 120 min) van 1 mL, met 1 x 106 cellen per tijdstip. Alle oplossingen zijn hetzelfde als in punt 1.1.<ol>
<li>Cultuur de schorsing cellen (bijvoorbeeld3T3, Jurkat) volgens een eerder gepubliceerde protocol9 , zodat er een voldoende aantal cellen ten tijde van het experiment, minstens 1 x 106 cellen per keer wijs en/of voorwaarde.</li>
		<li>Indien nodig, transfect cellen met verkrijgbare transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant, of viraal transduce8 de cellen 1 dag vóór de puls-chase met de juiste constructie voor expressie experiment.</li>
		<li>5 x 106 cellen per voorwaarde in een tube van 50 mL voor 5 min op 250 x g bij kamertemperatuur pellet, was ze 1 x met 5 mL honger media, pellet hen opnieuw en resuspendeer hen in 1 mL honger media.</li>
		<li>De cellen overbrengen in een waterbad 37 ° C en incubeer hen voor 10-25 min. Agitate de buizen elke 10-15 minuten om te voorkomen dat de cellen regelen onderaan.</li>
		<li>De timer te starten. Op precies 1 min, 275 µCi (55 µCi/1 x 106 cellen) van onverdunde label rechtstreeks toevoegen aan de buis met cellen en wervelen om te mengen. Opmerking: Bij het verwerken van radioactief materiaal, is het essentieel te volgen passende voorzorgsmaatregelen en lokale regels en voorschriften ter voorkoming van accidentele blootstelling en/of besmetting.</li>
		<li>Precies 11 min, stoppen door toevoeging van 4 mL chase media labelen. Meng het monster en onmiddellijk overbrengen in 1 mL een tube van 15 mL op ijs, met 9 mL ijskoud eindeoplossing. Opmerking: Dit is de 0 min chase steekproef.</li>
		<li>Herhaal deze stappen voor elke opeenvolgende tijdstip. Zodra alle tijdstippen worden verzameld, pellet de cellen gedurende 5 minuten bij 250 x g bij 4 ° C. Het medium gecombineerd (of overbrengen naar een nieuwe tube van 15 mL als volgende eiwit secretie). Wassen van de cellen met 5 mL van de oplossing van de stop- and -pellet de cellen gedurende 5 minuten bij 250 x g bij 4 ° C.</li>
		<li>De stop-oplossing gecombineerd, volledig lyse de cellen met 300 µL van ijskoude lysis buffer en incubeer hen gedurende 20 min op het ijs om een volledige lysis. Overdracht van de lysate een tube van 1,5 mL microcentrifuge en centrifuge voor 10 min bij 15,000-20,000 x g bij 4 ° C tot pellet de kernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunoprecipitation
<ol><li>Combineren van antilichaam (Zie de bespreking) en 50 µL van immunoprecipitation parels (bijvoorbeeld eiwit A-Sepharose) (10% schorsing [v/v] in lysis-buffermengsel + 0,25% bovien serumalbumine [BSA]) in een microcentrifuge buis en incubeer hen bij 4 ° C gedurende ongeveer 30 min. in een shaker.</li>
	<li>De kralen voor 1 min bij 12.000 x g bij kamertemperatuur pellet en het supernatant gecombineerd. Voeg 200 µL van lysate aan de antilichaam-kraal-mengsel en Incubeer bij 4 ° C in een shaker voor 1 h of kop-over-kop als de immunoprecipitation vereist > 1 h.</li>
	<li>Pellet de kralen voor 1 min bij 12.000 x g bij kamertemperatuur. De bovendrijvende substantie gecombineerd en voeg 1 mL immunoprecipitation was buffer. Leg het monster in een shaker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	<li>De kralen pellet zoals beschreven in stap 2.3 en herhaal het wassen 1 x. Vervolgens gecombineerd het supernatant en resuspendeer de kralen in 20 µL van TE buffer, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortex het monster.</li>
	<li>Voeg 20 µL van 2 x monster buffer zonder de reductiemiddel, vortex, verwarm het opnieuw gedurende 5 minuten bij 95 ° C, en vortex. Opmerking: als slechts voorbereiding reducerend monsters, 2 µL van 500 mM DTT moet worden toegevoegd op dit punt. Ga vervolgens verder met stap 2.7.</li>
	<li>Pellet de parels zoals beschreven in stap 2.3. 19 µL van het supernatans dat nonreduced overbrengen in een buis van de verse microcentrifuge met 1 µL van 500 mM DTT, centrifugeren van het monster, en de vortex eerder de verwarming het gedurende 5 minuten bij 95 ° C weer.</li>
	<li>Spin down de steekproef voor 1 min op 12.000 x g; Dit is het deelmonster. Afkoelen tot kamertemperatuur en 1.1 µL van 1 M NEM toevoegen aan zowel het lagere en het nonreduced monster. Vortex en spin down de monsters.</li>
</ol>3. SDS-PAGE
<ol><li>Bepaal eerst het juiste SDS-pagina oplossen gel percentage voor de proteïne van belang. Bijvoorbeeld, HIV-1 gp120, toen deglycosylated, ~ 60 kDa prestatiestatus en wordt geanalyseerd in een gel van 7,5%.</li>
	<li>Het oplossen gel mengsel zonder TEMED bereiden volgens de aanwijzingen van de fabrikant (x % acrylamide, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1% SDS [w/v], en 0,05% ammoniumnitraat persulfate [APS] [w/v]) en ontgas onder drukvermindering voor > 15 min. Terwijl het mengsel gel is ontgassing, grondig reinigen van de gel glasplaten met 70% ethanol en pluisvrije weefsels en plaats ze op een apparaat gieten.</li>
	<li>Voeg TEMED toe aan het mengsel van het oplossen gel (met een eindconcentratie van 0.005% [v/v]), meng en Pipetteer tussen de glazen platen, waardoor ~1.5 cm ruimte voor het stapelen van gel. Zorgvuldig overlay van de gel met gedeïoniseerd H2O of isopropanol en laat het polymeriseren.</li>
	<li>Zodra het oplossen gel heeft polymeervorm, bereiden de stapelvolgorde gel-mengsel (4% acrylamide, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 0,1% SDS [w/v], en 0,025% APS [w/v]).</li>
	<li>Leegmaken van de bovenkant van het oplossen gel met gedeïoniseerd H2O en verwijder vervolgens alle water. Opmerking: Gebruik filtreerpapier te verwijderen van de laatste druppels.</li>
	<li>Voeg TEMED aan de stapelvolgorde gel mengsel (0.005% [v/v]), meng, en bedekken het oplossen gel met stapelen gel en invoegen van een 15-well kam. Zodra de stapelvolgorde gel heeft polymeervorm, het overbrengen van een lopende kamer en vul de bovenste en onderste kamers met het runnen van de buffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine [pH 8.3] en 0,1% SDS [w/v]).</li>
	<li>10 µL van monster per rijstrook in een 15-baans minigel laden. Vermijd het laden van de monsters in de eerste en de laatste lane op de gel en laden de nonreducing monster buffer in alle lege rijstroken om te voorkomen dat de glimlachen van bands. Pas uitvoeren nadat de gels bij constant een 25 mA/gel de kleurstof voorzijde is aan de onderkant van de gel.</li>
	<li>Haal de gels uit de glasplaten, vlek de gels met eiwit-kleuring oplossing (azijnzuur 10% en 30% methanol in H2O + 0,25% briljant blauw R250 [w/v]) voor 5 min met agitatie, en vervolgens destain voor 30 min met destaining oplossing (kleuring oplossing zonder briljant blauw R250).</li>
	<li>Schik de gels gezicht naar beneden op een plastic wikkel en, vervolgens, plaats 0.4 mm chromatografie papier op de top van hen. Plaats de gel sandwich chromatografie papier-zijde naar beneden op een gel droger. Na instructies van de fabrikant, drogen de gels gedurende 2 uur bij 80 ° C.</li>
	<li>De gedroogde gels overbrengen in een cassette en bedekken ze met autoradiografie film of fosfor scherm. Als met behulp van autoradiografie film, moet deze stap worden uitgevoerd in een donkere kamer.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Puls-chase methoden zijn essentieel voor de ontwikkeling van wetenschappers inzicht in waar de eiwitvouwing in onbeschadigde cellen. Terwijl wij hebben geprobeerd om te verstrekken een methode die is zo algemeen mogelijk, heeft deze aanpak het potentieel voor bijna onbegrensd variaties om verschillende processen die zich voordoen tijdens het vouwen, het vervoer, en het leven van proteïnen in de cel te bestuderen.
Bij het uitvoeren van een puls-achtervolging aanhangend cuvetten in gerechten, is...

De vouwen van zelfs relatief eenvoudig eiwitten omvat vele verschillende opvouwbare enzymen, moleculaire chaperones en covalente wijzigingen1. Een volledige reconstructie van deze processen in vitro is praktisch onmogelijk, gezien het grote aantal verschillende componenten betrokken. Het is daarom zeer wenselijk, het bestuderen van in levende cellen waar de eiwitvouwing in vivo. Radioactieve pulse-jacht technieken blijken een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de synthese, vouwen, vervoer en afbraak van eiwitten in hun natuurlijke omgeving.
De metabole labeling van eiwitten tijdens een korte puls met 35S-geëtiketteerden methionine/cysteïne, gevolgd door een achtervolging in het ontbreken van een radioactieve label, kunt specifieke bijhouden van een bevolking van nieuw samengestelde eiwitten in de bredere cellulaire milieu. Vervolgens doel eiwitten kunnen worden geïsoleerd via immunoprecipitation en geanalyseerd via SDS-pagina of andere technieken. Voor veel eiwitten, wordt hun reis door de cel gekenmerkt door wijzigingen die zichtbaar op de SDS-pagina gel zijn. Bijvoorbeeld gaat het vervoer van geglycosyleerde eiwitten uit het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het Golgi-complex vaak gepaard met wijzigingen van N-gebonden glycanen of de toevoeging van O-gebonden glycanen2,3. Deze wijzigingen veroorzaken grote stijgingen in de schijnbare moleculaire massa, die kan worden gezien door mobiliteit veranderingen in SDS-pagina. Rijping kan ook worden gemarkeerd door Proteolytische breuklijnen, zoals de signaal-peptide decollete of de verwijdering van pro-peptides, wat resulteert in veranderingen in de schijnbare moleculaire massa die kan gemakkelijk worden gevolgd op SDS-pagina gel4. Radioactiviteit heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van vergelijkbare technieken zoals cycloheximide achtervolgingen, waar nieuwe eiwitsynthese wordt voorkomen, zoals langere behandelingen giftig voor de cellen zijn en sluit niet de meerderheid van de oudere, steady-state eiwitten uit de analyse, zoals sommige eiwitten hebben half-leven van dagen. De vergelijking van eiwitten onder beide nonreducing en vermindering van de voorwaarden kan de analyse van de vorming van de bond van bisulfide, een belangrijke stap in de vouwen van vele secretoire eiwitten4,5,6, 7.
Hier beschrijven we een algemene methode voor de analyse van de vouwing van eiwitten en vervoer in onbeschadigde cellen, met behulp van een radioactief pulse-chase-aanpak. Terwijl wij hebben gericht op de methode als gedetailleerd mogelijk, het protocol heeft een bijna onbegrensde mogelijkheden voor aanpassingsvermogen en optimalisatie te bestuderen van specifieke proteïnen van elke lezer zal toestaan.
Twee alternatieve pulse-chase protocollen, één voor Adherente cellen (stap 1.1 van het hier gepresenteerde protocol) en één voor schorsing cellen (stap 1.2 van het hier gepresenteerde protocol) worden verstrekt. De voorwaarden bedoeld hier volstaan om te visualiseren een eiwit uitgedrukt met middellange - tot hoog-expressie niveaus. Als de lezer met slecht uitgedrukte proteïnen of verschillende posttreatment omstandigheden, zoals meerdere immunoprecipitations werkt, is het noodzakelijk om te verhogen van de grootte van de schotel of cel nummer op de juiste manier.
Voor schorsing pulse chase, worden de chase-monsters op elk punt van de tijd genomen uit een enkele buis van cellen. De stappen wassen nadat de pols worden weggelaten; in plaats daarvan wordt verdere integratie van 35S verhinderd door verdunning met een hoge overmaat van labelloze methionine en cysteïne.
De gepresenteerde protocollen gebruiken radioactieve 35S-geëtiketteerden cysteïne en methionine te volgen van cellulaire eiwitvouwing processen. Alle bewerkingen met radioactieve reagentia moeten worden uitgevoerd met behulp van passende beschermende maatregelen om te minimaliseren van eventuele blootstelling van de exploitant en het milieu aan radioactieve straling en worden uitgevoerd in een aangewezen laboratorium. Als de puls-chase labeling techniek is relatief inefficiënt korte puls tijde (< 15 min), minder dan 1% van het beginbedrag van radioactiviteit is verwerkt in de onlangs samengestelde eiwitten. Na de verrijking van de target eiwit via immunoprecipitation bevat het monster voor SDS-pagina minder dan 0,05 procent van het beginbedrag van radioactiviteit.
Hoewel de 35S methionine en cysteïne labeling mix is gestabiliseerd, zal sommige ontleding, opbrengst van de vluchtige radioactieve stoffen, plaatsvinden. Ter bescherming van de onderzoeker en de apparatuur, moeten sommige voorzorgsmaatregelen worden genomen. De onderzoeker moet altijd de veiligheidsvoorschriften van de lokale straling gehoorzamen en een houtskool masker, naast een laboratoriumjas en (dubbele) handschoenen van de verpleegkunde mag dragen. Voorraad flesjes met 35S methionine en cysteïne moeten altijd worden geopend in een zuurkast of onder een lokale aspiratie-punt. Bekende laboratorium besmetting plekken zijn centrifuges, pipetten, waterbaden, incubatoren en shakers. De besmetting van deze gebieden wordt verminderd door het gebruik van de pipet tips met een houtskool filter, positief-seal microcentrifuge buizen (Zie Tabel of Materials), aquarium houtskool sponzen in water baden, houtskool filtreerpapier gelijmd in de puls-chase gerechten, houtskool bewaker in de aspiratie systeem, en de plaatsing van gerechten met houtskool korrels in voorbroeders en opslagtanks.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>glazuur azijnzuur</td></tr><tr><td>BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td><td>GE Life Sciences</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Bromfenolblauw</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR films</td><td>Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur media</td><td>Verschillende</td><td>N/A</td><td>Normaal celcultuur media voor specifieke cellijnen gebruikt</td></tr><tr><td>Celcultuur media, geen methionine/cysteïne</td><td>Verschillende</td><td>N/A</td><td>Hetzelfde mediaformulier als normaal cultuur media b.v. DMEM/MEM/RPMI, zonder methionine en cysteïne</td></tr><tr><td>Houtskoolfilterpapier</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>Houtskool gefilterde pipettips</td><td>Molecular bioproducts</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>Houtskool vacu-guard</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brillant Blauw R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>voor elektroforese</td></tr><tr><td>Cysteïne</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>moleculaire biologiekwaliteit, Maak 500 mM stock, bewaar bij -20&nbsp;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10199777001</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>Andere grootte batches van label zijn beschikbaar afhankelijk van gebruik</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Gel-droogapparatuur</td><td>Verschillende</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Grade 3 chromatography paper</td><td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delicate task wipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>moleculaire biologiekwaliteit, Maak 250 mM stock, bewaar bij -20</td></tr><tr><td>Minigel casting/running equipment</td><td>Verschillende</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>moleculaire biologiekwaliteit, Maak 1M stock in 100% ethanol, bewaar bij -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Protein-A Sepharose fastflow beads</td><td>GE health-care</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Trizma base (Tris)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Typhoon IP Biomolecular imager</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire Test Tube Rack 20 mm voor waterbad</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve pulse chase

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Puls-chase radioactieve labeling is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de conformationele rijping, het vervoer naar hun functionele cellulaire locatie, en de afbraak van doel proteÃ¯nen in levende cellen. Met behulp van korte (puls) radiolabeling keer (< 30 min) en streng gecontroleerd chase tijden, is het mogelijk om slechts een klein deel van de totale proteïne-pool label en volg de vouwen. Wanneer gecombineerd met nonreducing/vermindering van de Elektroforese van het gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) en immunoprecipitation met (conformatie-specifieke) antilichamen, kan vouwen processen worden onderzocht in groot detail. Dit systeem is gebruikt om te analyseren de vouwing van eiwitten met een enorme variatie in eigenschappen zoals oplosbare eiwitten, enkele en Multi-Pass transmembraan eiwitten, zwaar N - en O-geglycosyleerde eiwitten en proteïnen met en zonder uitgebreide bisulfide verlijmen. Puls-chase methoden vormen de basis van kinetische studies naar een aantal extra functies, waaronder co - en posttranslationele modificaties oligomerisatie en polymerisatie, waardoor in wezen de analyse van een eiwit vanaf de geboorte tot de dood. Puls-chase studies over de vouwing van eiwitten zijn complementair met andere biochemische en Biofysische methoden voor studeren eiwitten in vitro door verhoogde temporele resolutie en fysiologische informatie te bieden. De methoden zoals beschreven in dit document zijn gemakkelijk aangepast om te bestuderen de vouwen van bijna elk eiwit dat kan worden uitgedrukt in zoogdieren of insect-cel systemen.

De vouwen en afscheiding van HIV-1 gp120 vanaf een aanhangend pulse chase is afgebeeld in Figuur 2. De nonreducing gel (NR van de cellen in de figuur) toont de oxidatieve vouwen van gp120. Onmiddellijk na de pols labeling van 5 min (0 min chase) gp120 weergegeven als een diffuse band hoger in de gel, en naarmate de chase de band migreert naar beneden de gel door nog meer verspreid vouwen tussenproducten (IT) totdat het hoopt zich op in de strakke band (NT) di...

Hier beschrijven we een protocol voor een algemene pulse-chase-methode, waarmee de kinetische analyse van vouwing, vervoer en afbraak van eiwitten te volgen in levende cellen.

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

De radioactieve pulsjacht met behulp van 35 S-gelabelde methionine en cysteïne is nog steeds de enige biochemische methoden om eiwitbiosynthese met de tijd in levende cellen te onderzoeken. Eiwitbiosynthese omvat zowel vertaling, vouwen en assemblage, als handel en degradatie. Het combineren van de radioactieve pulsjacht met analyse van co-en post-translation eiwitmodificaties, zoals disulfide bindingsvorming en acetylatie, biedt een gevoelige en kwantitatieve test om het geloof van het eiwit met de tijd te onderzoeken.Voor deze procedure is een goede focus en experimentele behandeling vereist. Een goede voorbereiding is cruciaal, zoals buffers, uw radioactieve werkruimte en een duidelijk schema. Deze video biedt een duidelijk over de schouder weergave van de radioactieve puls chase protocol.Het demonstreren van de procedure zal Hui Ying Yeoh, een pHd kandidaat van ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, zaad transfect en cultuur cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor de pulsjacht, inspecteer je cellen door de microscoop.Was vervolgens de afwas met twee milliliter wasbuffer. En twee milliliter hongermedium naar de cellen en plaats de gerechten in een bevochtigd

analysis-protein-folding-transport-degradation-living-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische...

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor,...

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Leer de radioactieve pulse-chase methode met 35S-gelabelde methionine en cysteïne om eiwitbiosynthese, vouwing en afbraak in levende cellen te analyseren. Dit protocol biedt een kwantitatieve assay voor celbiologisch onderzoek.

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Meer video's verkennen