Isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid door fluorescentie-geactiveerde cel het sorteren

Dit protocol vergemakkelijkt de isolatie van functioneel verschillende fibroblast subsets van de menselijke huid door FAC sortering op basis van de cel oppervlak marker expressie. Voor het eerst kunnen papillaire en reticulaire fibroblasten rechtstreeks van de huid worden geïsoleerd zonder in vitro manipulatie. Dit is een enorme vooruitgang in vergelijking met eerder gevestigde isolatie methoden met behulp van explant culturen.

Dermale fibroblast subsets herbergen verschillende functies onder homeostatische omstandigheden. Met deze tool is het mogelijk om functionele verschillen in huidpathologieën te onderzoeken, waaronder kanker of ontstekingshuidziekten. Aangezien de behandeling van het menselijk weefsel enige oefening vereist om bevredigende celopbrengsten te bereiken, willen we een visuele demonstratie geven om dit proces te vergemakkelijken en te versnellen.

Om de dermis met volledige dikte voor te bereiden, plaatst u een stuk menselijke huid op een dik filterpapier met de opperhuid naar beneden gericht. Houd de opperhuid stevig vast met tangen en schraap de onderhuidse vetlaag af met een scalpel. Snijd het weefsel vervolgens in vijf millimeter brede reepjes voordat je ze in een petrischaaltje stopt.

Om de dermis in papillaire en reticulaire lagen te snijden, plaatst u een stuk huid op een dik filterpapier met de opperhuid naar boven gericht. Houd de huid stevig op de randen met tangen, en snijd een sectie van 300-micrometer dikte met een elektrische dermatome. Breng de eerste laag bestaande uit opperhuid en papillaire dermis over op een petrischaaltje.

Ga vervolgens onmiddellijk verder met het scheiden van de opperhuid en dermis, of voeg 1x PBS toe om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Pas vervolgens de dermatome aan op een snijdikte van 700 micrometer en snijd de resterende dermis. Plaats het bovenste plak, dat wordt gedefinieerd als de bovenste reticulaire dermis, in een aparte petrischaal.

Schraap vervolgens de onderhuidse vetlaag weg met een scalpel uit de resterende onderste reticulaire huidlaag en gooi deze weg. Verzamel de onderste reticulaire dermis in een andere petrischaal. Ga onmiddellijk over tot enzymatische spijsverteringsprocedure, of voeg 1x PBS toe om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt.

Om enzymatische vertering uit te voeren, plaatst u de huidstroken van vijf millimeter of de opperhuid/papillaire dermis met de opperhuid naar boven gericht in een petrischaal met 10 milliliter van de scheidende enzymoplossing. Vervolgens, incubeer de Petri schotel op 37 graden Celsius voor een uur. Breng na incubatie de opperhuid/papillaire dermis over op het deksel van de petrischaal.

Scheid de opperhuid van de bovenste dermis met twee tangen, die elk de rand van de dermis vasthouden. Maak vervolgens elke huidlaag zo grondig mogelijk. Hoe kleiner de stukken, hoe beter de weefselvertering.

Bereid vervolgens de spijsverteringsmix voor. Breng het gehakte weefsel met 10 millimeter van de bereide spijsverteringsmix over in een buis van 50 millimeter. Incubeer het weefsel op 37 graden Celsius gedurende een uur onder agitatie.

Keer de buis meerdere malen tijdens de spijsvertering. Om een eencellige suspensie voor te bereiden, stop de enzymatische weefselvertering door 10 milliliter fibroblastmedium toe te voegen aan het verteerde weefsel op ijs. Giet vervolgens de inhoud van elke buis door een gewone steriele roestvrije theezeef en verzamel de celopening in een schone petrischaal.

Was de zeef met medium en pureer de onverteerde weefselstukken met de rand van een spuitzuiger. Daarna, pipette de verzamelde cel suspensie door middel van een 70-micrometer cel zeef in een 50-milliliter buis. Spoel de celzeef met medium en verzamel de stroom door dezelfde buis.

Vervolgens, centrifuge de buis op 500 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant, en was de cel pellet met vijf milliliter van fibroblast medium. Herhaal de centrifugatiestap opnieuw.

Verwijder daarna de supernatant en zet de pellet opnieuw op in een milliliter ACK erythrocyte lyse buffer. Laat de cellen ongeveer één minuut in lysebuffer bij omgevingstemperatuur. Dan, stop lysis door het toevoegen van negen milliliter van 1x PBS met 10% FCS.

Centrifuge de buis opnieuw op 500 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant vervolgens. Nadat de cellen zijn gekleurd voor fac-sortering volgens standaardprotocollen, sorteer drie fibroblast subpopulaties in afzonderlijke microcentrifugebuizen gevuld met 350 microliters lysebuffer voor RNA-isolatie of 350 microliter fibroblast groeimedium voor celcultuur. Keer de buizen onmiddellijk om en zet de lysebufferbuizen in vloeibare stikstof, of zet de fibroblast groeimediumbuizen op ijs.

Na FACS, draai de cellen naar beneden op 500 keer g gedurende drie minuten op vier graden Celsius. Dan, plaat een gelijke hoeveelheid cellen in fibroblast groeimedium in een 24-goed celkweek schotel, en laat ze groeien totdat ze 70% samenvloeiing te bereiken. Vervang vervolgens het gekweekte celmedium door adipocyte differentiatiemedium en laat de cellen 14 dagen differentiëren.

Op differentiatiedag 14, bevestig de cellen met 4%PFA gedurende 20 minuten. Was de putten met 60% isopropanol en laat deze volledig verdampen. Dan, vlek de cellen met vijf millimolars van gefilterde olie Rode O gedurende 20 minuten.

Na 20 minuten was je de gekleurde cellen vier keer met gedestilleerd water. Beeld de cellen ondergedompeld in water met een omgekeerde microscoop bij 10x vergroting met uitgezonden licht. Dit protocol maakt de identificatie van drie fibroblast populaties in de menselijke huid, die presenteert met verschillende intradermale lokalisatie, genexpressie profielen, en functies.

FAP-positieve CD90-negatief zijn verrijkt in de papillaire dermis, terwijl FAP-positieve CD90-positieve en FAP-negatieve CD90-positief zijn meer in overvloed in de reticulaire dermis. Alle drie gesorteerde subpopulaties tonen gedurende zeven dagen typische fibroblastmorfologie op cultuur. Interessant is dat ze zich anders gedragen in een adipogenese test.

Na 14 dagen in de cultuur, FAP-positieve CD90-negatief niet onderscheiden in adipocyten, terwijl FAP-positieve CD90-positieve en FAP-negatieve CD90-positieve gemakkelijk ondergaan adipogenese. Genexpressie profilering blijkt dat FAP-positieve CD90-negatieve cellen hoge niveaus van markers vaak toegeschreven aan papillaire fibroblasten, zoals CD26, NTN, en PDPN uitdrukken, terwijl CD90-positieve cellen uitdrukken de bekende reticular markers, zoals CD36, gladde spieractine, en PPAR-gamma op hoge niveaus. We concluderen dat FAP-positieve CD90-negatieve cellen behoren tot de papillen en CD90-positieve cellen behoren tot de reticulaire lijn.

Spijsvertering werkt het beste als de huid stukken grondig worden gehakt en geïncubeerd in een voldoende hoeveelheid spijsvertering medium. Dermale fibroblast subsets zijn functioneel divers. Het verkennen van hun functie in het kader van ziektepathogenese zal de weg vrijmaken voor nieuwe diagnostische en therapeutische interventies.