Un essai à base d’électrochimie pour Les variantes de protéines MeCP2

L’ECLIA est une méthode simple mais efficace pour quantifier les niveaux cellulaires de MeCP2. L’ECLIA est rapide, plus sensible et plus facile à manipuler par rapport à d’autres méthodes de quantification telles que la tache occidentale et l’ELISA. Pour préparer la solution de lavage, qui est de 0,5%Tween 20 en PBS, ajouter 500 microlitres de Tween 20 à un litre de PBS et mélanger vigoureusement.

Préparer une solution de blocage de 3% Bloqueur A et PBS et remuer doucement. Stériliser la solution de blocage par filtration. Pour préparer la solution diluant d’essai, 1% Bloqueur A, et PBS, ajoutez cinq millilitres de solution de blocage à 10 millilitres de PBS.

Ensuite, décongelez l’anticorps anti-MeCP2 de souris monoclonal sur la glace. Mélanger 0,67 microlitres de l’anticorps avec quatre millilitres de PBS, puis vortex de la solution. Pour enrober la plaque de liaison haute de 96 puits, distribuez soigneusement 25 microlitres de solution de revêtement dans le coin inférieur de chaque puits, à l’aide d’un pipetter multicanal.

Tamponnez doucement la plaque de 96 puits de chaque côté pour vous assurer que la solution de revêtement couvre le fond de chaque puits. Sceller la plaque avec du papier adhésif et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Récupérer la plaque de 96 puits du réfrigérateur et retirer le papier d’aluminium.

Retirez la solution de revêtement anticorps dans les puits en la faisant glisser dans un conteneur à déchets. Puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier pour enlever toute solution restante. Ensuite, ajoutez 125 microlitres de solution de blocage à chaque puits.

Sceller ensuite à nouveau la plaque avec du papier adhésif. Placez la plaque sur un shaker microplaqué orbital, réglé à 800 RPM et incubez-la pendant 90 minutes à température ambiante. Décongeler sur la glace un flacon de solution de stock de protéines MeCP2 ou Tat-MeCP2, de lysates cérébraux de souris et de lysates HDF.

Diluer la solution de stock de protéines dans des tubes propres tel que décrit dans le tableau deux du manuscrit. Ensuite, diluer les échantillons de lysate. Pour le cerveau de la souris lysates, utiliser un à 20 microgrammes par 25 microlitres de tampon de lyse.

Pour le lysate HDF, ajouter 0,25 à un microgramme par 25 microlitres de tampon de lyse. Après l’incubation de la plaque de 96 puits pendant 90 minutes, retirez la solution de blocage des puits en la faisant glisser dans un conteneur à déchets. Puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier pour enlever toute solution restante.

Lavez ensuite la plaque trois fois avec 150 microlitres de solution de lavage, en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement. Ajouter 25 microlitres de normes et d’échantillons aux puits de la plaque de 96 puits. Sceller la plaque et l’incuber pendant encore quatre heures à température ambiante avec des secousses constantes de 800 RPM.

Décongeler l’anticorps de détection non étiqueté, anti-MeCP2 de lapin polyclonal, sur la glace. En utilisant la solution diluante d’essai, diluer l’anticorps à un rapport de 1 à 6000. Lorsque la plaque de 96 puits est terminée en incubation sur le shaker, retirez les normes et les échantillons en faisant glisser la plaque dans un conteneur à déchets.

Puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier pour enlever toute solution restante. Lavez la plaque trois fois avec 150 microlitres de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement. Ajouter 25 microlitres de solution anticorps de détection non étiquetée à chaque puits avec le pipetter multicanal.

Sceller la plaque et l’incuber pendant une heure à température ambiante avec des secousses constantes à 800 RPM. Obtenez l’anticorps secondaire spécifique du réfrigérateur et placez-le une glace. Diluer le corps secondaire dans une solution diluante d’essai et mélanger délicatement.

Pour retirer l’anticorps de détection sans ceinture de la plaque de 96 puits, faites un film dans le conteneur à déchets, puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier. Après avoir lavé la plaque trois fois comme perviously décrit, ajouter 25 microlitres d’anticorps secondaires à chaque puits avec le pipetter multicanal. Sceller la plaque et l’incuber pendant une heure à température ambiante avec des secousses constantes à 800 RPM.

Retirez l’anticorps secondaire gratuit en feuilletant dans le conteneur à déchets et en tapant la plaque sur une serviette en papier, puis lavez la plaque trois fois, comme décrit précédemment. À chaque puits de la plaque, ajouter 150 microlitres de 1X Tris base Gold Read Buffer avec surfactant, contenant de la tripropylamine comme coreactant pour la production de lumière. Pour éviter de produire des bulles d’air, utilisez des techniques de pipetage inversé.

Placez la plaque de 96 puits sur la plate-forme microplaquée avec système de détection d’électrochimieluminescence. À l’aide de la caméra CCD intégrée, commencez immédiatement à capturer des données. Enregistrez les nombres de signaux qui correspondent à des unités lumineuses relatives et qui sont directement proportionnels à l’intensité de la lumière.

Les courbes standard meCP2 ont été générées à partir du MeCP2 humain dans de multiples mesures. L’ECLIA peut quantifier avec précision le MeCP2 humain recombinant sur une plage d’un nanogramme par millilitre à 1800 nanogrammes par millilitre. À l’aide d’ECLIA, les niveaux de protéines MeCP2 ont été mesurés dans les lysates nucléaires du cerveau à partir d’hétérozygotes et de souris femelles de type sauvage et d’une souris KO MeCP2.

ECLIA a été mené sur des lysates cellulaires à partir d’un contrôle sain et de la lignée cellulaire c. 806delG utilisée comme modèle pour le syndrome de Rett. Aucune protéine MeCP2 n’a été détectée dans les lignées cellulaires mutantes par ECLIA ou par immunofluorescence.

ECLIA a également été utilisé pour étudier l’adoption de Tat-MeCP2 par la ligne cellulaire déficiente MeCP2 heures supplémentaires. Eclia entre et la précision intra-analyse a été déterminée sur trois jours consécutifs. Pour la future thérapie de remplacement des protéines, l’administration de MeCP2 peut être optimisée à plusieurs reprises après évaluation du niveau de protéines par l’ECLIA.