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方法文章

利用循环死亡供体心脏的大鼠异位心脏移植模型

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DOI：

10.3791/63844

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2022年5月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Department of Surgery, Virginia Commonwealth University, 2Pauley Heart Center, Virginia Commonwealth University Health System, 3Department of Surgery, McGuire Veterans Administration Medical Center, 4Department of Pharmacotherapy and Outcome Science, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 5Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Virginia Commonwealth University

本文内容

摘要

本文描述了利用循环死亡供体心脏进行小鼠异位心脏移植的制备过程及技术细节。

摘要

本实验方案的目的是建立一种采用循环死亡后捐献（DCD）供体心脏的大鼠异位心脏移植模型。该方案包括两个部分：供体心脏准备和受体准备。在供体心脏准备阶段，Sprague Dawley 大鼠接受麻醉、经气管插管并进行机械通气。通过右颈动脉插管给予肝素和肌松剂维库溴铵。通过停止通气启动 DCD 过程。停止通气 20 分钟后，暴露心脏，并在头臂干远端夹闭主动脉。在停止通气 25 分钟时，通过颈动脉导管灌注冰冻的威斯康星大学（UW）溶液以冲洗心脏。随后切断主动脉、肺动脉、上下腔静脉及肺静脉，获取供体心脏，并将其保存于 UW 溶液中以备移植。在受体准备阶段，Lewis 大鼠使用异氟烷进行麻醉，并皮下注射缓释布托啡诺以促进术后平稳恢复。通过腹部正中切口暴露肾下腹主动脉和下腔静脉，并使用无创血管夹夹闭。将供体心脏的主动脉和肺动脉分别以连续缝合法使用 8-0 Prolene 缝线吻合至受体的腹主动脉和下腔静脉。移除血管夹以恢复心脏灌注。缝合腹壁后，使大鼠苏醒。在设定的时间间隔（24 小时至 2 周）后，再次麻醉受体大鼠，暴露移植心脏，并经心尖插入带球囊导管至左心室，利用数据采集系统记录左心室发展压及 dP/dt。随后取心脏组织用于组织学、免疫学或分子生物学分析。成功建立 DCD 供体大鼠心脏移植模型将有助于进一步研究心肌保护策略，以改善 DCD 供体心脏移植的预后。

引言

心脏移植（HTx）的小动物模型对于开展研究移植心脏所受影响的病理生理状况至关重要。根据Oto和Lindsey描述的啮齿类动物异位HTx模型，研究人员得以研究在缺血与再灌注条件下观察到的病理生理变化1。传统上，用于移植的供体心脏来源于跳动心脏供体，也称为脑死亡后捐献（DBD）供体；然而，需要进行HTx的患者数量却在不成比例地增加2。近年来，在实验环境中已开始使用循环死亡后捐献（即循环停止后捐献，DCD）供体的心脏进行移植3。DBD与DCD供体心脏之间的主要区别在于，后者的心脏经历了不同持续时间的缺血，因而限制了其在常规HTx临床实践中的应用。

既往文献报道的啮齿类异位心脏移植（HTx）仅采用了跳动心脏供体条件4,5,6。异位无心跳供体（DCD）心脏移植则需要进行细微的技术调整，否则移植后心脏将无法恢复搏动7。本方案旨在向读者介绍一种经过优化的大鼠DCD心脏移植技术。全心肌缺血是DCD器官捐献固有的特征。目前仅在ex vivo（离体）模型中研究过模拟全心肌缺血的实验设置5。由于in vivo（DCD）与ex vivo全缺血模型之间存在显著差异5，ex vivo研究的结果可能无法直接应用于DCD心脏移植研究。因此，在ex vivo模型中针对减轻再灌注心肌缺血损伤所进行的干预措施，其效果或无效性在DCD HTx模型中可能无法重现。因此，建立一种能够模拟人类DCD心脏移植的动物模型至关重要，由此获得的研究结果具有更高的转化价值。本文所述的DCD HTx模型可使研究人员更真实地模拟临床DCD心脏移植过程，并为在供体心脏和受体两方面实施干预以减轻再灌注损伤提供研究平台。在受体大鼠恢复后，可于移植后不同时间点对移植心脏的功能、组织病理学及免疫学特征进行评估。

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方案

所有动物实验均按照机构指南以及美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 86-23，2011 年修订版）进行8。以下操作程序已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会的批准。所有操作均遵循职业安全与健康管理局（OSHA）指南以及推荐的无菌技术9。Sprague Dawley 大鼠饲养于湿度受控的环境中，温度为 23 °C，光照周期为 12 小时明/暗循环。

1. 实验室的设置

注意：应指定专用区域，在体视显微镜下进行无菌啮齿类动物存活手术。手术室环境温度应保持温暖；在手术及术后恢复过程中使用加热垫，对维持受体大鼠体温至关重要。

  1. 准备并妥善存放必需用品（材料表），包括注射器、0.9% 生理盐水（NaCl）、麻醉剂（异氟烷、氯胺酮/赛拉嗪）、肝素、维库溴铵、器官保存液、冰桶以及镇痛剂（缓释型丁丙诺啡），确保随时可用。
  2. 将显微外科器械整齐摆放于手术区域（图1A，B）。随时备好快速灭菌包，以便立即清洁被污染的关键器械。

2. 在体 大鼠DCD供体准备

  1. 为进行气管插管和颈动脉插管，先对大鼠实施麻醉。将Sprague Dawley大鼠（8–12周龄）置于3%异氟烷麻醉舱中镇静，随后以氯胺酮/赛拉嗪（100/10 mg/kg，肌内注射）进行麻醉。
  2. 为暴露气管和右侧颈动脉，将完全麻醉的大鼠仰卧放置，并用酒精和聚维酮溶液清洁颈部前方和胸部。在正中线做V形切口，V的顶点靠近大鼠下颌，V的两臂分别指向同侧肩部。分离皮肤与皮下组织，并将皮肤翻向胸部，以暴露颈部的带状肌（图2A）。
    1. 用镊子分离正中线的带状肌（胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌），暴露气管，进行气管插管（图2B）。用5-0丝线环绕气管，并在气管软骨环之间的部分肌肉组织上做切开，打开气管。
    2. 将14 G套管针插入气管，并用5-0丝线固定（图2C）。将套管针连接至呼吸机（1 mL/kg，90次/分钟）。
    3. 进行右侧颈总动脉插管时，辨认颈总动脉（其与气管平行，位于气管右侧紧邻处），小心将其从颈部全长游离，并用5-0丝线结扎远端（颅侧）。
    4. 将结扎线的游离端连接至止血钳，用于牵拉，以方便颈动脉插管。
    5. 游离颈动脉最靠近近端的部分（朝向颈部基底部），并用血管止血钳夹闭。在手术显微镜下，使用显微虹膜剪在远端最前端前侧部分切开颈动脉。用22 G套管针进行颈动脉插管，并用5-0丝线固定（图2D）。
    6. 在套管针上连接三通流控阀接头，以便于将药物或心脏停搏液注入颈动脉；同时连接压力传感器，用于在DCD过程中监测心率和血压（图2D）。当松开近端血管夹时，应观察到血液出现搏动性反流。
    7. 固定后，将颈动脉导管连接至压力传感器，并给予肝素（1,000 U/kg）和维库溴铵（4 mg/kg）。
    8. 启动DCD过程：让维库溴铵循环1分钟。观察动物是否有任何痛苦迹象，必要时追加麻醉。停止呼吸机（造成缺氧/缺血），以启动DCD过程。观察呼吸活动是否消失。
      注：DCD缺血时间从撤除呼吸机支持时开始计算。在大鼠中，25分钟的缺血时间已被确定为可导致显著但可逆性损伤的最长时间7。压力波形显示，从呼吸支持中断约3.5分钟起，全身血压下降至50 mmHg以下，此压力被认为不足以有效灌注心脏（图3）。
  3. 供体心脏获取：分配约4–7分钟用于获取心脏并灌注冷心脏停搏液。为达到25分钟的目标缺血时间，应在停止呼吸支持后18–21分钟开始心脏获取。
    注：根据操作者的经验调整获取时间。
    1. 从剑突水平开始，沿肋缘切开腹壁，然后在胸骨两侧平行切开肋骨，直至锁骨，完成双侧前胸廓切开术（图4A）。使用手术显微镜在低倍放大（5×）下辅助此步骤。
    2. 将沿锁骨铰接的切开胸壁向上翻向头部，并用止血钳固定（图4B）。
    3. 用5-0丝线环绕下腔静脉（IVC），然后在靠近肝脏穹窿处用显微剪部分切开（图4C）。部分开放的IVC可使心脏停搏液流出，同时扩张右心。
    4. 分离升主动脉与肺动脉（PA）之间的间隙，然后通过横窦使用钝头弯镊将肺动脉干游离至其分叉处。用显微剪小心地在肺动脉分叉点附近将其切断（图4C）。
    5. 钝性分离主动脉弓周围组织，以便将小型直角血管夹置于无名动脉起始部远端的主动脉弓上。
    6. 在停止呼吸机后第25分钟时，夹闭主动脉弓，并通过颈动脉导管手动灌注心脏停搏液（4 °C的威斯康星大学溶液10 mL，持续2–3分钟）（图4D）。
    7. 使用显微剪在主动脉弓远端切断升主动脉（图4E）。
    8. 用5-0丝线向心脏方向结扎IVC，并在其远端切断。
    9. 用5-0丝线一起结扎肺静脉和上腔静脉（SVCs）（图4F）。由于这些结扎涉及大量组织，建议采用手打结而非器械打结。用棉签轻轻将心脏向下腹部方向牵拉，以利于结扎肺静脉，同时避免心耳组织被卷入结扎线中。
    10. 用显微虹膜剪切断肺静脉，取出心脏并置于冰盐水中（图4G）。

3. 体内 大鼠 DCD 异位心脏移植

  1. 将受体置于异氟烷麻醉舱中进行镇静（3%诱导浓度），剪除腹部区域的毛发，并使用聚维酮碘和酒精清洁该区域。受体无需抗凝处理；否则将导致吻合口出血过多及移植物失败。
  2. 将大鼠仰卧置于加热垫上，在大鼠与加热垫之间放置探头以监测温度，维持大鼠体温在38 °C。在大鼠腹部两侧各放置一个装有温热生理盐水或玻璃珠的50 mL预灭菌离心管，以帮助保温。
  3. 尽管已采取上述步骤，若体温仍降至37.5 °C以下，应提高室温（RT），并使用经高压灭菌的铝箔覆盖身体所有暴露部位，仅留出足以进行腹部手术的区域。
  4. 通过鼻罩使用3%异氟烷诱导全身麻醉，并逐渐降低至2%。
  5. 沿腹白线切开腹部图 5A）并通过放置腹壁拉钩来暴露手术区域图5B).
  6. 使用无菌棉签将扩张或充盈的结肠移开，并将其置于操作者左侧温热湿润的纱布上， periodically 用温热（38 °C）生理盐水冲洗图5C将结肠移开可为DCD心脏提供更多空间，因为DCD心脏非常僵硬，需要额外空间以容纳于腹腔内。
  7. 使用棉签钝性分离正中切开后腹膜。暴露肾下腹主动脉和下腔静脉。
  8. 使用无创小儿多角度血管钳，游离3-5 mm的肾下腹主动脉和下腔静脉用于吻合（图 5D).
  9. 用连接在1 cm注射器上的30 G针头穿入主动脉3 注射器内装有混有100单位肝素的生理盐水。用0.2–0.3 mL该溶液冲洗（图5E用无菌棉签轻轻吸去多余的溶液，因为肝素可能被吸收，导致缝合线处出血。
  10. 使用显微剪刀沿长轴切开主动脉，以匹配供体主动脉的大小。此时不应打开下腔静脉，也不要试图在下腔静脉与主动脉之间分离出间隙；否则将导致出血。
  11. 吻合过程中供体心脏的正确方位至关重要（图5F将供体心脏调整至吻合位置，使右心室前表面朝向天花板，心尖指向操作者右侧，且供体主动脉略低于肺动脉。此方位可减少肺动脉吻合口的张力。
    1. 主动脉吻合：使用尖头针持和精密镊子进行显微血管吻合。采用8-0单丝缝线，缝于锥形4 mm针尖上，装在0.3 mm针头持针器上，操作时取下针持锁，以避免锁紧和松开时对组织造成意外损伤。
    2. 在主动脉吻合口的6点钟位置放置一根牵引缝线，以提供对称且止血的缝合线。然后从12点钟位置开始吻合，供体主动脉采用外进内出，受体主动脉采用内进外出的方式进行缝合图6A，B保留5-7厘米的可用缝线，其余部分剪除。
    3. 逆时针移动，沿路径行进 短距离向6点钟位置移动，然后通过将心脏向左翻转，以逆时针方向继续完成至12点钟位置的吻合图6C).
    4. 结扎前检查缝合线是否有松动。
      注意：吻合口应牢固且对称，必须使供体与受体的内膜紧密贴合，无任何间隙。
    5. 肺动脉吻合：将肺动脉从主动脉上游离，并调整方向，使其在无扭曲的情况下与下腔静脉进行吻合。通过皮下注射（颈背部）3–5 mL生理盐水，补充受体血容量以充盈供体心脏，避免发生低血压。
    6. 监测大鼠的呼吸模式，并在肺动脉吻合即将完成时，将异氟烷浓度从2.0%降至1.5%。
    7. 在主动脉吻合口头侧，使用显微虹膜剪刀切开下腔静脉图6C使用0.2–0.3 mL生理盐水冲洗下腔静脉。可见少量血凝块；需小心冲洗。
    8. 与主动脉吻合不同，肺动脉吻合开始时无需使用固定缝线，因其会妨碍术野暴露。从12点位置开始，缝针方向为从供体肺动脉外侧进针、内侧出针，受体下腔静脉内侧进针、外侧出针。打结后，首先顺时针方向完成后壁吻合。
    9. 到达6点钟位置后，继续顺时针缝合，直至完成12点钟位置，然后将缝线与前一结的短端打结固定。注意避免过紧收紧吻合口，因为任何狭窄都会限制心脏的静脉回流。通常情况下，完成两个吻合口平均需要30分钟或更短时间。
    10. 在吻合口处放置小块可吸收止血材料，以控制针孔处的出血。
    11. 松开血管夹，根据需要在针孔处添加更多的可吸收止血材料（图6E移植的心脏开始跳动，偶尔出现纤维性颤动，随后恢复节律性搏动。只要心脏仍在跳动且无明显出血，将可吸收止血剂留置原位5分钟。
    12. 止血满意后（约3-5分钟），使用无菌棉签清除多余的可吸收止血材料，以生理盐水冲洗，并将肠管还纳回腹腔图6F将大网膜覆盖于吻合口处，以协助止血。
    13. 用5-0单丝缝线（Monocryl）穿13 mm切割针，分两层缝合腹壁，先缝合白线，再缝合皮肤图6G，H).

4. 恢复与监测

  1. 完成腹部关闭后，将大鼠置于温暖垫上，使其腹部朝下以恢复。通过鼻罩继续给予1%异氟烷5分钟，然后停止。
  2. 当大鼠自主呼吸恢复规律后，将其转移至清洁的恢复笼中，并放置在温暖垫上继续恢复过程。大鼠的突然移动可能导致出血风险或吻合口扭转。在手术开始前给予长效镇痛剂可显著促进恢复过程的顺利进行。

5. 对照搏动心脏的获取与移植

  1. 获取作为对照的跳动心脏供体（CBD）心脏，以评估在无缺血情况下的供体心脏质量。
    ​注意：CBD 供体经历的所有步骤与 DCD 心脏所述步骤相同，唯一区别在于不停止呼吸机支持。CBD 心脏在心脏跳动且完全由呼吸机支持的情况下获取。通过施用心脏停搏液使心脏停搏，随后以与 DCD 心脏相同的方式完成获取和移植操作。

6. 移植心脏功能评估：

  1. 在心脏移植后预定的时间间隔（24 小时至 14 天），用 3% 吸入式异氟烷麻醉受体大鼠，将其仰卧于加热垫上，打开腹部切口以暴露移植的心脏。
  2. 通过左心室心尖插入带球囊导管，测量收缩压（DP）、最大 +dP/dt 和最小 −dP/dt。
    注：此处使用 PowerLab 系统作为血压记录的数据采集系统。

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结果

异位心脏移植术后24小时至14天，可重新打开腹腔，暴露心脏以测量左心室产生的压力。将带有球囊尖端的导管插入DCD（或CBD）心脏的左心室内，以测量其发展压（DP）、最大+dp/dt和最小−dp/dt。图7展示了移植后24小时DCD心脏与CBD心脏预期DP、+dp/dt和−dp/dt的示例。与CBD心脏相比，DCD心脏的发展压显著降低，且+dp/dt（最大值）和−dp/dt（最小值）均恶化。

手术工具设置；镊子、持针器、止血钳、缝合技术；教学示意图。
图1：异位大鼠心脏移植中使用的显微血管器械。 （1）...

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讨论

要成功实施大鼠DCD异位心脏移植（HTx），必须建立细致周密的实验准备。详细的准备工作需考虑多个因素，包括：1）选择年轻大鼠作为DCD供体；2）使用异氟烷作为首选麻醉剂；3）向供体心脏有效灌注停跳液；4）将供体心脏保存在冰冻溶液中；5）在不损伤腰血管的前提下，仅进行有限的腹部解剖，以暴露肾下腹主动脉和下腔静脉；6）在手术期间及术后维持受体体温；7）使用无血管夹钳以分离下腔静脉和主动脉，便于吻合；8）确保受体腹腔内有足够的空间容纳较硬的DCD供体心脏；9）选用合适的显微血管器械；10）避免对受体进行抗凝处理；11）精细地完成止血性血管吻合；以及12）术前给予镇痛，以确保术后平稳恢复。本文所述方案详细说明了每一步操作，以成功重复实验结果。

本文所述的DCD大鼠异位心脏移植（HTx）方法借鉴了自1964年Abbott首次描述小鼠心脏移植以来文献中报道的多种改进措施10。上述方案中的关键改进包括麻醉剂的选择：使用异氟烷作为麻醉剂便于监测和调节至所需的麻醉深度。将供体心脏主动脉和肺动脉与受体腹主动脉和下腔静脉进行侧-侧吻合，取代Abbott最初...

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披露

本文作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了授予 Mohammed Quader 博士的优异评审基金（1I01 BX003859）以及 Pauley 心脏中心向 Mohammed Quader 和 Stefano Toldo 博士提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-0 尼龙缝线 聚酰胺单丝Aros SurgicalSP17A05N-45
5-0 丝线缝线Surgical SpecialtiesSP116
8-0 单丝缝线Aros SurgicalT06A08N14-13
高压灭菌器SterisAmsco Lab 250
BD 胰岛素注射器 带可拆卸针头 1 mL 注射器Fisher Scientific14-820-28
BD 带鲁尔锁扣头端的注射器（无针头）10 mL 注射器Fisher Scientific14-823-16E
Belzer 大学威斯康星冷保存液Bridge to Life Northbrook IL USA腺苷 1.34 g/L，别嘌呤醇 0.136 g/L，谷胱甘肽 0.922 g/L，乳糖酸（以内酯形式）35.83 g/L，七水硫酸镁 1.23 g/L，五组分 50 g/L，氢氧化钾 5.61 g/L，磷酸二氢钾 3.4 g/L，棉子糖五水合物 17.83 g/L
Buprenorfin SR 实验室制剂Zoopharm LLC
Debakey 无创儿科多角度血管夹AesculapF341T
Exel 国际一次性 Safelet 静脉导管 14 GFisher Scientific14-841-10
Exel 国际一次性 Safelet 静脉导管 22 GFisher Scientific14-841-20
Fogarty 导管 4F 规格Edwards Lifesciences120404F
带弯曲尖端的镊子Accurate Surgical & Scientific Instruments CorporationASSI.228
Gaymar 加热泵Braintree Scientific, Braintree, MA, USATP700
Germinator-500Braintree Scientific
肝素钠注射液，USP 1,000 U/mLPfizerNDC 0069-0137-01
直头虹膜显微剪Accurate Surgical & Scientific Instruments CorporationASSI.5253
异氟烷 USPPatterson VeterinaryNDC 14043070406
盐酸氯胺酮 100 mg/mLHenry ScheinNDC 6745710810
盐酸利多卡因 2%Aspen Veterinary07-892-4325
McKesson General Medical 6 英寸 Q-TIPS 2STER 木柄 100 支/包Fisher ScientificNC0650323无菌棉签
显微剪，直角和弯曲尖端Braintree ScientificSC-MS 154
持针器Accurate Surgical & Scientific Instruments CorporationASSI.BSL158已移除锁定机制
生理盐水Baxter Infusion supplies
PowerLab 工作站AD Instruments, Denver, CO数据采集系统
氢氧化钠/盐酸将溶液调节至 pH 7.4
Sprague Dawley 大鼠雄性，8–16 周龄，<400 g 体重
手术显微镜Leika型号 M525 F40
SurgicelEthicon可吸收止血剂
温度探头 Therma 防水型 T 型高精度热电偶测温仪ThermoworksTHS-232-107
高精度尖头镊子Excelta17-456-109
维库溴铵Sigma-AldrichPHR1627用 PBS 稀释至 100 mg/mL
VenteliteHarvard Apparatus, Holliston, MA, USA
赛拉嗪 100 mg/mLPivetal AnasedNDC 04606675002

参考文献

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  15. Quader, M., Mezzaroma, E., Wickramaratne, N., Toldo, S. Improving circulatory death donor heart function: A novel approach. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery Techniques. 9, 89-92 (2021).

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