Name: Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer hoe je glycosomale pH-dynamiek meet in levende Trypanosoma brucei met behulp van een pH-biosensor en flowcytometrie. Deze methode ondersteunt high-throughput screening van parasietrespons op voedingsveranderingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

pHluorin2-PTS1 werd gekloond in pLEW100v5 door Twist Bioscience, die het construct leverde in een kloonvector met hoge kopieën; pLEW100v5 was een geschenk van Dr. George Cross. Antiserum tegen T. brucei aldolase is op aanvraag verkrijgbaar bij Dr. Meredith T. Morris, Clemson University. Het werk van de JCM- en KAC-laboratoria werd gedeeltelijk ondersteund door een prijs van de National Institutes of Health (R01AI156382). SSP werd ondersteund door NIH 3R01AI156382.

Ontwikkeling van een op pHluorin2 gebaseerde sensor voor glycosomale pH in Trypanosoma brucei

<ol><li>Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+in+the+African+trypanosome%3A+Targeting+enzymes+and+their+subcellular+compartments+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development.</a> Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).</li>
<li>Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+carbon+metabolism+in+the+macrophage+phagolysosome-+feast+or+famine%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine.</a> F1000Res. 4, 938(2015).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li>
<li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li>
<li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li>
<li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li>
<li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li>
<li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phluorin2%3A+An+enhanced%2C+ratiometric%2C+pH-sensitive+green+florescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li>
<li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Restriction digest v.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2">https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2</a> (2018).</li>
<li>Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
<li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744(2020).</li>
<li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+excretion+of+glycolytic+products+is+associated+with+acidification+of+the+parasitophorous+vacuole+during+parasite+egress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress.</a> PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139(2022).</li>
<li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li>
<li>Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+transfected+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).</li>
<li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Omgevingsperceptie en responsmechanismen in het Afrikaanse trypanosoom zijn slecht begrepen. Het is bekend dat veranderingen in de beschikbaarheid van voedingsstoffen verschillende reacties in de parasiet veroorzaken, waaronder verzuring van glycosomen. Hier hebben we een methode beschreven om de glycosomale pH-respons op omgevingsverstoringen in levende cellen te bestuderen met behulp van een erfelijke eiwitsensor, pHluorin2, en flowcytometrie.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het ge...

Parasitaire kinetoplastiden zijn, net als de meeste levende organismen, afhankelijk van glucose als een fundamenteel onderdeel van het centrale koolstofmetabolisme. Deze groep omvat medisch belangrijke organismen, zoals de Afrikaanse trypanosoom, Trypanosoma brucei; de Amerikaanse trypanosoom, T. cruzi; en parasieten van het geslacht Leishmania. Het glucosemetabolisme is van cruciaal belang voor de groei van parasieten in de pathogene levenscyclusstadia. Bij gebrek aan glucose sterft bijvoorbeeld de bloedbaanvorm (BSF) van het Afrikaanse trypanosoom snel af. Met name glycolyse dient als de enige bron van ATP tijdens dit stadium van infectie1. Leishmania-parasieten zijn eveneens afhankelijk van glucose in de menselijke gastheer, waarbij de levenscyclusfase van amastigote die zich in de macrofagen van de gastheer bevindt, afhankelijk is van deze koolstofbron voor groei2.
Hoewel deze parasieten verschillende levensstijlen hebben waarbij verschillende insectenvectoren betrokken zijn, hebben ze veel overeenkomsten in de manier waarop ze reageren op en glucose consumeren. Deze parasieten lokaliseren bijvoorbeeld de meeste glycolytische enzymen in gemodificeerde peroxisomen die glycosomen worden genoemd. Dit kinetoplastid-specifieke organel is verwant aan peroxisomen van zoogdieren op basis van geconserveerde biosynthetische mechanismen en morfologie 3,4,5,6.
De compartimentering van de meeste enzymen van de glycolytische route in het glycosoom biedt parasietspecifieke manieren om de route te reguleren. Met behulp van een chemische pH-sonde hebben we vastgesteld dat nutriëntendeprivatie een snelle verzuring van procyclische vorm (PF) parasietglycosomen veroorzaakt, wat resulteert in veranderde glycolytische enzymactiviteit door blootstelling van een allosterische regulatorbindingsplaats op het belangrijkste glycolytische enzym hexokinase 7,8. In ons vorige werk had de chemische sonde een constante toevoer nodig voor gebruik, waardoor het nut ervan in andere toepassingen werd beperkt. Bovendien beperkten uitdagingen om de sondeverdeling in het glycosoom in de BSF te handhaven het nut van de benadering voor het onderzoeken van de glycosomale pH in die levensfase.
In deze studie hebben we de fluorescerende eiwitbiosensor pHluorin2 gebruikt om de glycosomale pH-verandering in BSF T. brucei te volgen als reactie op omgevingssignalen, waaronder glucose-uithongering9 (Figuur 1). De resultaten van dit werk suggereren dat BSF T. brucei glycosomen snel verzuurt als reactie op uithongering op een omkeerbare manier, vergelijkbaar met reacties die we hebben waargenomen bij PF-parasieten. We verwachten dat deze biosensor ons begrip van glycolytische regulatie in T. brucei en verwante parasieten zal verbeteren.

<table><tbody><tr><td>50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 &micro;L flat-bottom 384-well plate</td><td>BrandTech&nbsp;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Human T Cell Nucleofector&nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>A24858</td><td>FlowJo software</td></tr><tr><td>BRANDplates 96-Well, flat bottom plate</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>Coloc 2 plugin of ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr><td>CytKick Max Auto Sampler</td><td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Flow Cytometer</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>statistisch software</td></tr><tr><td>Nigericin (sodium salt)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>Discontinued Product</td><td></td></tr><tr><td>OP2 Liquid Handler</td><td>opentrons</td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O</td><td>Sigma Life Science</td><td>CAS:25988-63-0</td><td>Pipettering robot voor HTS-test</td></tr><tr><td>Thiazole Red (TO-PRO-3)</td><td>biotium</td><td>#40087</td><td>We hebben een aangepaste acryl plaatstandaard gemaakt, zodat dit merk plaat kon worden gedetecteerd en gebruikt op onze CytKick Max Auto Sampler</td></tr><tr><td>valinomycin</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009152</td><td>Pipettering robot voor HTS-test</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>Voor pH-kalibratie</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>Voor pH-kalibratie</td></tr></tbody></table>

meten van dynamische glycosomale ph-veranderingen bij levende trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Het glucosemetabolisme is van cruciaal belang voor de Afrikaanse trypanosoom, Trypanosoma brucei, als een essentieel metabolisch proces en regulator van de ontwikkeling van parasieten. Er is weinig bekend over de cellulaire reacties die worden gegenereerd wanneer de glucosespiegels in de omgeving veranderen. Bij zowel bloedbaan- als procyclische parasieten (insectenstadium) herbergen glycosomen het grootste deel van de glycolyse. Deze organellen worden snel verzuurd als reactie op glucosedeprivatie, wat waarschijnlijk resulteert in de allosterische regulatie van glycolytische enzymen zoals hexokinase. In eerder werk was het lokaliseren van de chemische sonde die werd gebruikt om pH-metingen uit te voeren een uitdaging, waardoor het nut ervan in andere toepassingen werd beperkt.
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van parasieten die glycosomaal gelokaliseerd pHluorin2 tot expressie brengen, een erfelijke proteïne pH-biosensor. pHluorin2 is een ratiometrische pHluorin-variant die een pH-(zuur)-afhankelijke afname van de excitatie vertoont bij 395 nm en tegelijkertijd een toename van de excitatie oplevert bij 475 nm. Transgene parasieten werden gegenereerd door het open leesframe pHluorin2 te klonen in de trypanosoomexpressievector pLEW100v5, waardoor induceerbare eiwitexpressie in beide levenscyclusfasen mogelijk werd. Immunofluorescentie werd gebruikt om de glycosomale lokalisatie van de pHluorin2-biosensor te bevestigen, waarbij de lokalisatie van de biosensor werd vergeleken met het glycosomale residente eiwit aldolase. De reactiesnelheid van de sensor werd gekalibreerd bij verschillende pH-waarden door cellen te incuberen in een reeks buffers die in pH varieerden van 4 tot 8, een benadering die we eerder hebben gebruikt om een op fluoresceïne gebaseerde pH-sensor te kalibreren. Vervolgens hebben we pHluorin2-fluorescentie gemeten bij 405 nm en 488 nm met behulp van flowcytometrie om de glycosomale pH te bepalen. We valideerden de prestaties van de levende transgene parasieten die pHluorin2 tot expressie brachten, waarbij we de pH in de loop van de tijd volgden als reactie op glucosedeprivatie, een bekende trigger van glycosomale verzuring bij PF-parasieten. Deze tool heeft een reeks potentiële toepassingen, waaronder mogelijk worden gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen met een hoge doorvoer. Naast de glycosomale pH kan de sensor worden aangepast aan andere organellen of worden gebruikt in andere trypanosomatiden om de pH-dynamiek in de levende celomgeving te begrijpen.

pHLuorin2-PTS1 lokalisatie naar glycosomen in BSF T. brucei Om de subcellulaire lokalisatie van de pHluorin2-PTS1 te beoordelen, werden parasieten onderworpen aan immunofluorescentietests. Signaal van het transgen gelokaliseerd met anti-sera verhoogd tegen een glycosoom-resident eiwit, aldolase (TbAldolase) (Figuur 2A). De gemiddelde Pearson's correlatiecoëfficiënt van colokalisatie tussen anti-TbAldolase en pHluorin2-PTS1 was 0,895, wat aangeeft dat pHluorin2-PT...

We beschrijven een methode om te bestuderen hoe pH reageert op omgevingssignalen in de glycosomen van de bloedbaanvorm van Afrikaanse trypanosomen. Deze aanpak omvat een pH-gevoelige erfelijke eiwitsensor in combinatie met flowcytometrie om de pH-dynamiek te meten, zowel als een tijdverlooptest als in een high-throughput screen-formaat.

Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Het glucosemetabolisme is van cruciaal belang voor Trypanosoma brucei, maar er is weinig bekend over hoe de cellen veranderende glucosespiegels in de omgeving waarnemen en erop reageren. We hebben parasieten ontwikkeld die een pH-biosensor tot expressie brengen waarmee we de glycosomale pH in levende parasieten kunnen volgen, wat zal helpen bij het begrijpen van de dynamische reacties van parasieten op fluctuaties in voedingsstoffen. Een uitdaging voor dit experiment zou de beschikbaarheid zijn van een flowcytometer uitgerust met een microtiterplaatlezer, evenals de juiste filtersets om de fluorescentie van biosensoren te meten.Bovendien is T.brucei een organisme van risicogroep twee, dus de cytometer moet worden ondergebracht in een faciliteit van bioveiligheidsniveau twee. Er is ontdekt dat de pH-waarde van glycosomen de glycolyse kan beïnvloeden, aangezien hexokinase en fosfofructokinase pH-gevoelig zijn. De pH-sondes die eerder werden gebruikt, richtten zich echter niet nauwkeurig op het glycosoom in de bloedbaanvorm.Er was een beter hulpmiddel nodig om de relatie tussen glycosomale pH en glycolyse in deze levensfase van de parasiet te bestuderen. De pHluorin2-PTS1-sensor is ee

measuring-dynamic-glycosomal-ph-changes-in-living-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De dynamica van glycosomen in Afrikaanse trypanosomen is moeilijk te bestuderen met traditionele celbiologietechnieken zoals elektronen- en fluorescentiemicroscopie. Als middel om dynamisch orgaangedrag waar te nemen, is een fluorescentie-orgaanrapportagesysteem gebruikt in combinatie met flowcytometrie om de glycosoomdynamica in real-time in levende parasieten te monitoren.

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

Dit manuscript beschrijft het gebruik van een bioluminescente stam van Afrikaanse trypanosomen om de tracking van een late infectiefase mogelijk te maken en demonstreert hoe in vivo live beeldvorming kan worden gebruikt om infecties binnen het centrale zenuwstelsel in real-time te visualiseren.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Het toevoegen van een tag aan een eiwit is een krachtige manier om inzicht te krijgen in zijn functie. Hier beschrijven we een protocol om honderden Trypanosoma brucei-eiwitten parallel endogenetisch te taggen, zodat tagging op genoomschaal haalbaar is.

High-throughput Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Afrikaanse trypanosomen die in vitro gekweekt worden, ondergaan antigeenvariatie met een lage snelheid, zodat populaties bestaan uit parasieten die een dominante variant van het oppervlakteglycoproteïne (VSG) en een kleine populatie van 'geschakelde' varianten tot expressie brengen. Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het detecteren en kwantificeren van deze populaties.

detectie van<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

We beschrijven een high-throughput colorimetrische test die β-galactosidase-activiteit meet in drie levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de veroorzaker van de ziekte van Chagas. Deze test kan worden gebruikt om trypanocidale verbindingen op een eenvoudige, snelle en reproduceerbare manier te identificeren.

In vitro Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen

Telomeren zijn essentieel voor chromosoom stabiliteit en de telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase-gemedieerde telomeren onderhoud. We hebben onlangs twee methoden voor het detecteren van de telomeer G-overhang structuur...

Onderzoek van de telomeren G-overhang Structuur in Trypanosoma brucei</em

Dit artikel zal detail het protocol voor het meten van calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen met behulp van flow cytometrie.

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Een gelijktijdige infectie met influenza A-virus is een van de factoren betrokken bij de inductie van invasieve pneumokokkeninfecties bij...

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

Dit artikel beschrijft de procedure voor het bereiden van een fluorescentie-gemerkte versie van bacteriofaag lambda, infectie...

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

Leer hoe je glycosomale pH-dynamiek meet in levende Trypanosoma brucei met behulp van een pH-biosensor en flowcytometrie. Deze methode ondersteunt high-throughput screening van parasietrespons op voedingsveranderingen.

Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei

Meer video's verkennen