Name: Generierung von patienteneigenen Podozyten aus Hautbiopsien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie die episomale Reprogrammierung von Hautfibroblasten zu hiPSCs und deren Differenzierung zu patienteneigenen Podozyten. Diese Methode ermöglicht personalisierte Krankheitsmodelle für die Nephrologieforschung.

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Diese Arbeit wurde gefördert durch das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg mit dem Förderkennzeichen M4-IZKF-F009 an Janina Müller-Deile und vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) unter dem Projektnamen STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, Förderkennzeichen 01GM2202D an Janina Müller-Deile. Wir danken Annalena Kraus für die Unterstützung bei der Aufnahme von REM-Aufnahmen.

Verwendung von Hautbiopsien zur Erzeugung von patienteneigenen Podozyten

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses auf Zellkulturen basierende Protokoll kombiniert die episomale Reprogrammierung von humanen dermalen Fibroblasten in patientenspezifische hiPS-Zellen und die anschließende Differenzierung in aus hiPS-Zellen stammende Podozyten. Dies ermöglicht es uns, mutationsbedingte Veränderungen von Podozyten von Patienten mit genetischer glomerulärer Erkrankung in Bezug auf Podozytenschäden zu untersuchen. Das Protokoll zur Reprogrammierung dermaler Fibroblasten mit einer integrationsfreien Methode durch Elektroporation wurde aus den veröffentlichten Arbeiten von Bang et al.32 und Okita et al.33 adaptiert. Das Protokoll zur Unterscheidung von Podozyten und hiPS-Zellen ist an das veröffentlichte Protokoll von Musah et al.28,34,35 angepasst. Es liegen bereits Publikationen vor, die die Entstehung von Podozyten aus hiPSCs beschreiben 27,34,35. Das hier vorgestellte Protokoll ist jedoch optimiert und kostengünstiger hinsichtlich der Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten. Im Vergleich zum veröffentlichten Protokoll von Musah et al. testeten wir dieses Protokoll an verschiedenen Beschichtungsreagenzien, wie Vitronektin, Lamininseide-511 und solubilisierter Basalmembranmatrix. Die Konzentrationen von Vitronektin und Lamininseide-511 konnten auf 2,5 μg/ml statt 5 μg/ml 28,34,35 gesenkt werden. Darüber hinaus war es möglich, die Konzentrationen von BMP7 und Activin A, zwei sehr teuren Wachstumsfaktoren, um 50% von 100 ng/ml auf 50 ng/ml zu senken.
Dies ermöglicht eine kostengünstigere Differenzierung. Nephron-Vorläuferzellen von Tag 7 vermehrten sich noch, und die Möglichkeit des Einfrierens wurde bereits zuvor gezeigt. Wir expandierten diese Zellen nach dem Auftauen und vor der endgültigen Differenzierung in einem Basismedium, das Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und B27 enthielt, über mehrere Tage, wodurch die Kosten noch weiter gesenkt wurden. Zusätzlich zu den Differenzierungsschritten beschreibt dieses Protokoll das Auswachsen von Fibroblasten aus Hautbiopsien mit anschließender Generierung patientenspezifischer hiPS-Zellen durch episomale Reprogrammierung. Die Kombination dieser beiden Methoden ermöglicht die Generierung patientenspezifischer Podozyten. Daher wird hier ein vollständiges Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung patientenspezifischer hiPSC-abgeleiteter Podozyten bereitgestellt, das bisher nicht so detailliert beschrieben wurde.
Da das Gesamtprotokoll mehrere verschiedene Zelltypen umfasst, ist es wichtig, die generierten Zelltypen in verschiedenen Schritten zu charakterisieren. Die Zellen befinden sich über einen längeren Zeitraum in Kultur, daher sollte die Qualitätskontrolle an verschiedenen Stellen durchgeführt werden. Bei der Arbeit mit hiPS-Zellen ist eine tägliche Fütterung sowie eine Überwachung des Zellverhaltens und der Morphologie erforderlich. Die Sterilität der Differenzierungsmedien muss durch eine Filtersterilisation durch einen 0,2 μm Filter sichergestellt werden. Das gesamte Protokoll, von der Hautbiopsie bis zu den aus hiPS-Zellen gewonnenen Podozyten, dauert mehrere Monate, aber es ist möglich, die Zellen in verschiedenen Phasen des Prozesses einzufrieren. Fibroblasten, ausgewählte hiPSC-Klone und proliferative Nephron-Vorläuferzellen können nach 7 Tagen in Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium eingefroren und eine funktionierende Zellbank generiert werden.
Obwohl aus hiPSC stammende gesunde Podozyten ein ausgeprägtes Netzwerk von primären und sekundären Fußfortsätzen entwickeln (Abbildung 5A,B) und typische Podozyten-spezifische Marker exprimieren (Abbildung 6A-C), sind charakteristische Spaltmembranen, wie sie in vivo zu sehen sind, in klassischen zweidimensionalen Zellkulturmodellen nur schwer nachzuahmen. Darüber hinaus ist eine Interzellkommunikation mit anderen glomerulären Zelltypen in dieser Monokultur nicht möglich.
Aufgrund ihres terminalen differenzierten Zustands und ihrer mangelnden Proliferationskapazität ist es schwierig, Podozyten ex vivo zu untersuchen. Mit Hilfe der bedingten Immortalisierung primärer Podozyten ist es möglich, diese Einschränkung durch das Einsetzen eines thermosensitiven Schalters zu überwinden, was zu einem Zellkulturmodell führt, in dem sich die Zellen bei 33 °C vermehren und bei 37 °C differenzieren13,14. Obwohl diese ciPodozyten ein hohes Potenzial für die Podozytenforschung haben, gibt es Einschränkungen, wie z. B. das Fehlen einer Markerexpression, eine dedifferenzierte Morphologie und das Versagen bei der Bildung von Fußfortsätzen15,16.
Die Differenzierung von Podozyten aus patienteneigenen somatischen Zellen ermöglicht die Generierung und den Vergleich von erkrankten Podozyten mit gesunden Kontrollzellen ex vivo. Dies ermöglicht es uns, Podozytenschäden aufgrund von Mutationen in Podozyten-spezifischen Genen zu untersuchen. Darüber hinaus hat die Arbeit mit hiPS-Zellen das Potenzial, dreidimensionale Zellkultur-Krankheitsmodelle bzw. Organoide zu erstellen43,44. Die Kokultur von hiPSC-abgeleiteten Podozyten mit anderen glomerulären Zellen, wie glomerulären Endothelzellen oder Mesangialzellen, könnte zu neuen Erkenntnissen über die Kommunikation zwischen Zellen in der Gesundheit und bei glomerulären Erkrankungen führen.
Darüber hinaus kann die Charakterisierung und Behandlung der patientenspezifischen Podozyten ex vivo in der Hochdurchsatzanalytik durchgeführt werden. Der individualisierte Ansatz eröffnet die Möglichkeit, neuartige therapeutische Targets für spezifische Mutationen zu untersuchen und in Zukunft individualisierte Medizin zu betreiben.

Podozyten sind spezialisierte, postmitotische Nierenepithelzellen, die zusammen mit der glomerulären Basalmembran (GBM), glomerulären Endothelzellen und Glykokalyx die glomeruläre Filtrationsbarriere der Niere bilden. Phänotypisch bestehen Podozyten aus einem Zellkörper und primären, Mikrotubuli-getriebenen Membranfortsätzen sowie sekundären Fortsätzen, die als Fußfortsätze bezeichnetwerden 1,2. Die glomeruläre Filtrationsbarriere, die Urin aus dem Blut filtert, besteht aus gefenstertem Endothel, GBM und einer speziellen Art von interzellulärer Verbindung, die benachbarte Podozytenfußfortsätze verbindet, die als Schlitzdiaphragma von Podoctyes3 bezeichnet werden. Unter gesunden Bedingungen werden Proteine, die größer als Albumin sind, aufgrund ihrer Größe und Ladung von der Filtrationsbarriere zurückgehalten4.
Es ist bekannt, dass Mutationen in zytoskelett- oder podozytenspezifischen Genen sowie zirkulierende Faktoren, die die Podozyten-Signalwege beeinflussen, eine Podozyten-Effazion, -Ablösung oder -Apoptose induzieren, was zu Proteinurie und glomerulärer Sklerose führt. Insbesondere die Umlagerung des Zytoskeletts, Veränderungen der Podozytenpolarität oder die Schädigung von Fußfortsätzen mit einem damit verbundenen Verlust von Spaltverbindungen sind von zentraler Bedeutung5. Aufgrund ihres terminalen differenzierten Zustands können Podozyten nach der Ablösung des GBM kaum noch ersetzt werden. Wenn Podozyten jedoch an das GBM gebunden sind, können sie sich immer noch von der Auslöschung erholen und die interdigitierenden Fußfortsätze reformieren 6,7,8. Ein besseres Verständnis der Ereignisse, die zu Podozytenschäden bei verschiedenen glomerulären Erkrankungen führen, könnte neue therapeutische Angriffspunkte liefern, die bei der Entwicklung von Behandlungen für diese Krankheiten helfen werden. Die Podozytenschädigung ist ein Kennzeichen verschiedener glomerulärer Erkrankungen, einschließlich der fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS), der diabetischen Nephropathie, der Minimal-Change-Krankheit und der membranösen Glomerulonephropathie, die zuverlässige Podozyten-Ex-vivo-Modelle erfordern, um die pathologischen Mechanismen und potenziellen Behandlungsansätze für diese Erkrankungen zu untersuchen 9,10. Podozyten können ex vivo durch klassische primäre Zellkultur untersucht werden, basierend auf der Isolierung von Glomeruli durch differentielle Siebung11. Aufgrund des terminalen differenzierten Zustands mit begrenzter Proliferationskapazität verwenden die meisten Forscher jedoch Maus- oder humane ciPodozyten-Zelllinien, die temperaturempfindliche Varianten des SV40-Antigens large T exprimieren. Alternativ werden ciPodozyten aus transgenen Mäusen isoliert, die das SV40-Tag-immortalisierende Gen 1,12 tragen.
CiPodozyten vermehren sich bei 33 °C, treten aber bei 37 °C in Wachstumsstopp ein und beginnen sich zu differenzieren13,14. Es ist zu beachten, dass experimentelle Daten, die mit diesen Zellen gewonnen wurden, mit einer gewissen Vorsicht interpretiert werden sollten, da die Zellen durch eine unnatürliche Geninsertion erzeugt werden15. Da diese Zellen ein immortalisierendes Gen beherbergen, ist die zelluläre Physiologie aufgrund der fortschreitenden Proliferation verändert12. Die mit diesem Ansatz erzeugten Podozytenzelllinien wurden kürzlich in Frage gestellt, da ciPodozyten von Mäusen, Menschen und Ratten weniger als 5 % Synaptopodin und Nephrin auf Proteinebene sowie NPHS1 und NPHS2 auf mRNA-Ebene im Vergleich zur glomerulären Expressionexprimieren 16. Darüber hinaus exprimieren die meisten Podozytenzelllinien kein Nephrin17,18. Chittiprol et al. beschrieben auch einen signifikanten Unterschied in der Zellmotilität und der Reaktion auf Puromycin und Doxorubicin in ciPodozyten16. Podozyten können im Urin nach Ablösung vom GBM bei verschiedenen glomerulären Erkrankungen gefunden werden 19,20,21,22. Lebensfähige Podozyten im Urin können ex vivo für bis zu 2-3 Wochen kultiviert werden, aber die meisten Zellen durchlaufen eine Apoptose23,24. Interessanterweise finden sich Podozyten nicht nur im Urin von Patienten mit glomerulärer Erkrankung, sondern auch im Urin gesunder Probanden, höchstwahrscheinlich wenn sie wieder seneszent sind und ein begrenztes Replikationspotenzial in Kulturhaben 24. Darüber hinaus ist die Anzahl der aus dem Urin stammenden Podozyten begrenzt, und die Zellen dedifferenzieren sich in der Kultur, zeigen weniger Fußfortsätze, verändern die Morphologie und haben vor allem eine begrenzte Proliferationskapazität. Die Expression von Podozyten-spezifischen Genen fehlt, verschwindet innerhalb weniger Wochen oder variiert zwischen diesen Zellklonen. Einige Zellen, die positiv für den Podozyten-spezifischen Marker waren, koexprimierten den Marker von tubulären Epithelzellen oder Myofibroblasten und Mesangialzellen, was auf eine Dedifferenzierung und/oder Transdifferenzierung der kultivierten Urinpodozyten hindeutet24,25.
Kürzlich wurde die Erzeugung von ciPodocyte-Zelllinien beschrieben, die aus dem Urin von Patienten und gesunden Probanden durch Transduktion mit einem thermosensitiven SV40 large T-Antigen und hTERT gewonnen wurden26. Die mRNA-Expression von Synaptopodin, Nestin und CD2-assoziiertem Protein wurde nachgewiesen, aber Podocin-mRNA fehlte in allen Klonen. Zusätzlich zu den Problemen mit den Podozyten im Urin enthalten diese Zellen auch das eingefügte immortalisierende Gen, was zu den oben diskutierten Nachteilen führt.
Im Gegensatz dazu haben humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) eine enorme Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und sich unter geeigneten Bedingungen in mehrere Zelltypen zu differenzieren. Es wurde bereits gezeigt, dass hiPS-Zellen als nahezu unbegrenzte Quelle von Podozyten dienen können27,28.
In dieser Arbeit wird ein zweistufiges Protokoll zur Generierung patientenspezifischer Podozyten aus dermalen Fibroblasten von Hautstanzbiopsien mit anschließender episomaler Reprogrammierung in hiPS-Zellen und einer abschließenden Differenzierung in hiPSC-abgeleitete Podozyten beschrieben (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Abbildung 1: Protokoll zur Generierung patientenspezifischer hiPSC-abgeleiteter Podozyten. Grafische Übersicht über das Protokoll zur Generierung patientenspezifischer Podozyten aus dermalen Fibroblasten einer Hautbiopsie durch Reprogrammierung in hiPS-Zellen und Differenzierung in Podozyten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
In einem ersten Schritt wurden somatische dermale Fibroblasten aus einer Hautstanzbiopsie herausgewachsen und mittels einer integrationsfreien Methode durch Elektroporation mit Plasmiden, die die Transkriptionsfaktoren OCT3/4, KLF4, SOX2 und c-MYC exprimieren, zu hiPSCs reprogrammiert 29,30,31. Entstehende hiPSC-Kolonien wurden anschließend selektiert und erweitert. Die Differenzierung begann mit der Induktion der mesodermalen Linie durch Aktivierung des WNT-Signalwegs, gefolgt von der Bildung von Nephron-Vorläuferzellen, die noch in der Lage waren, sich zu vermehren. Schließlich wurden die Zellen in Podozyten differenziert. In diesem Verfahren modifizierten und kombinierten wir bereits veröffentlichte Protokolle zur episomalen Reprogrammierung zur Erzeugung von hiPS-Zellen von Bang et al.32 und Okita et al.33 sowie ein Protokoll zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten von Musah et al.28,34,35.
Tatsächlich wiesen die mit unserem Protokoll erzeugten Podozyten einen Phänotyp auf, der den Podozyten in vivo näher kam, was die Entwicklung eines ausgeprägten Netzwerks von primären und sekundären Fußfortsätzen und die Expression von Podozyten-spezifischen Markern wie Synaptopodin, Podocin und Nephrin betrifft. Durch die Verwendung von aus hiPS-Zellen gewonnenen Podozyten bleibt der genetische Hintergrund des Patienten während der Reprogrammierung und Differenzierung erhalten. Dies ermöglicht eine patientenspezifische Podozyten-Krankheitsmodellierung und die Entdeckung potenzieller therapeutischer Substanzen ex vivo in einer nahezu unbegrenzten Zellzahl. Darüber hinaus ist dieses Protokoll minimalinvasiv, kosteneffizient, ethisch vertretbar und kann neue Wege für die Arzneimittelentwicklung eröffnen.

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; m Sterilfilter</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>zur Sterilisation des Differenzierungsmediums</td></tr><tr><td>all-trans Retinsäure</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td>Supplement zur Differenzierung</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50 x), serumfrei</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Supplement für serumfreies Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Silk</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>zusätzliche Option eines extrazellulären Matrixreagenzes zur Verwendung in einer Beschichtungslösung zur Beschichtung von Zellkulturkunststoffen, die für hiPSC-Kultur geeignet</td></tr> sind <tr><td>Rinderserumalbumin (BSA).</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Filterkappe Zellkulturflaschen, T75, 250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>Zellkulturkunststoffe geeignet für Fibroblastenkulturen</td></tr><tr><td>CHIR99021 (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>Ergänzung zur Differenzierung</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>zusätzliche Option eines extrazellulären Matrixreagenzes, das in einer Beschichtungslösung verwendet wird, um Zellkulturkunststoffe zu beschichten, die für hiPSC-Kulturen geeignet sind (solubilisierte Basalmembranmatrix)</td></tr><tr><td>countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>zur Zählung von Zellen</td></tr><tr><td>countess II FL&nbsp; Automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>zum Zählen von Zellen</td></tr><tr><td>KryoPure Röhrchen, 2 ml, QuickSeal Schraubverschluss, weiß</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>Kryoröhrchen zum Einfrieren von Zellen</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO) &nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>für Fibroblasten-Gefriermedium</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>Basismedium für die Differenzierung</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>Basismedium für Fibroblastenmedium</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>Phasenkontrastmikroskop</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum Premium, inaktiviert (FCS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P301902</td><td>Serum für Fibroblastenmedium, Fibroblasten-Gefriermedium und Podozyten-Erhaltungsmedium</td></tr><tr><td>fisherbrand Elektroporationsküvetten Plus, 4 mm Spalt, 800 & Mikro; L-Kapazität, sterile</td><td>Fisherbrand</td><td>FB104-Küvette</td><td>für die Elektroporation/episomale Reprogrammierung von Fibroblasten (4 mm Abstand)</td></tr><tr><td>Fluormount-G-Eindeckmedium, mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>Eindeckmedium mit DAPI-Einbettnadel</td></tr><tr><td>(0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>zur Trennung von hiPS-Kolonien in kleine Stücke</td></tr><tr><td>humanes rekombinantes Activin-A-Protein</td><td>78001.1</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Stammzelltechnologien</td><td>zur Differenzierung</td></tr><tr><td>humanes rekombinantes morphogenetisches Knochenprotein 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>Nahrungsergänzungsmittel zur Differenzierung</td></tr><tr><td>humanes VEGF-165 Rekombinantes Protein</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>Nahrungsergänzungsmittel zur Differenzierung</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen (ITS-G) (100 x)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>Ergänzung für Podozyten-Erhaltungsmedium</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>für den Sterilitätstest von hiPSC-Kulturen</td></tr><tr><td>lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>kommerzielles Mykoplasmen-Detektionskit</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21.102</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete</td><td>Kit Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>Basismedium für serumfreies hiPSC-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Nalgene Gefrierbehälter Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>um optimale Gefrierbedingungen zu gewährleisten</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>ABCAM</td><td>AB 7481</td><td>für Vorinkubationslösung und Antikörper-Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>Nunc 24-Well-Platten</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>Zellkulturkunststoffe, geeignet für hiPSC-Kulturplatten</td></tr><tr><td>Nunc 48-Well-Platten&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>Zellkulturkunststoffe, geeignet für hiPSC-Kultur-Nunc</td></tr><tr><td>6-Well-Platten&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>Zellkulturkunststoffe, geeignet für hiPSC-Kulturen</td></tr>, <tr><td>100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>Zellkulturkunststoffe, geeignet für hiPSC-Kulturen</td></tr><tr><td>, nunC 96-Well, Nunclon Delta-behandelte Mikrotiterplatten,</td> Thermo <td>Scientific</td><td>167008</td><td>Zellkulturkunststoffe, geeignet für hiPSC-Kulturen</td></tr>, <tr><td>nutriFreez D10 Kryokonservierungsmedium</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>serumfreies Kryokonservierungsmedium für die Kryokonservierung von hiPSC- und Nephron-Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>Elektroporationsmedium&nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgen</td><td>#27079</td><td>Plasmid für episomale Reprogrammierung</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>Plasmid für episomale Reprogrammierung</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK Plasmid</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>Plasmid für episomale Reprogrammierung</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>zur Vermeidung bakterieller Kontamination</td></tr><tr><td>Kunststoff Deckgläser</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>für Immunfluoreszenzfärbungen von hiPSCs und hiPSC-abgeleiteten Podozyten</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>kommerzielles Paraformaldehyd (4 %) zur Fixierung von Zellen</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>Basismedium für Podozytenerhaltungsmedium</td></tr><tr><td>Färbekammer StainTray Schwarzer Deckel</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>stemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>enzymatische Zellablöselösung zur Dissoziation von hiPSCs</td></tr><tr><td>sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>zum Waschen und Beschichten</td></tr><tr><td>von sterilem Wasser</td><td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>Spritze ohne Nadel 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>zum Filtrieren Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>TC-Schale 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>sterile Zellkulturkunststoffe zum Schneiden der Hautbiopsie und Fibroblastenkultur</td></tr><tr><td>TC-Schale 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>sterile Zellkulturkunststoffe zur Auswuchs von Fibroblasten aus Hautbiopsie</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>zur Vorinkubationslösung&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4 %) zur Verwendung mit dem Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>zur Zellzählung</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (10 x)&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>X0930-100</td><td>Dissoziationsreagenz für Fibroblasten und Nephron-Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>Röhrchen 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Vitronektin ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>Reagenz aus extrazellulärer Matrix zur Beschichtung von Zellkulturkunststoffen, geeignet für hiPSC-Kulturen</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid (10 mg)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>zur Vermeidung der Apoptose von hiPSCs während der Spaltung</td></tr><tr><td><stark>Primäre Antikörper</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>Pluripotenzmarker, Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>Pluripotenzmarker, Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Proliferationsmarker, Verdünnung 1:300</td></tr><tr><td>Synaptopodin</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>Podozyten-spezifischer Marker, Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Nephrin</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>Podozyten-spezifischer Marker, Verdünnung 1:25</td></tr><tr><td>Podocin</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>Podozyten-spezifischer Marker, Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td><stark>Sekundäre Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Guinea-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>sekundärer Antikörper, Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, stark kreuzadsorbierter</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td><td>Sekundärantikörper, Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>Sekundärantikörper, Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>Sekundärantikörper, Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Sekundärantikörper, Verdünnung 1:1000</td></tr></tbody></table>

generierung von patienteneigenen podozyten aus hautbiopsien

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podozyten sind Epithelzellen, die auf der Harnseite der glomerulären Filtrationsbarriere sitzen und zur selektiven Filterfunktion des Glomerulus beitragen. Mutationen in Podozyten-spezifischen Genen können eine fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) verursachen, und Podozyten sind auch bei vielen anderen primären und sekundären Nephropathien betroffen. Aufgrund ihrer differenzierten Natur sind primäre Zellkulturmodelle für Podozyten begrenzt. Daher werden üblicherweise bedingt immortalisierte Zellen verwendet. Diese bedingt immortalisierten Podozyten (ciPodocytes) weisen jedoch einige Einschränkungen auf: Die Zellen können sich in Kultur dedifferenzieren, insbesondere wenn sie eine Konfluenz erreichen, und mehrere Podozyten-spezifische Marker werden entweder nur geringfügig oder gar nicht exprimiert. Dies stellt den Einsatz von ciPodozyten und ihre Anwendbarkeit für physiologische, pathophysiologische und klinische Reichweiten in Frage. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung von humanen Podozyten - einschließlich patientenspezifischer Podozyten - aus einer Hautstanzbiopsie durch episomale Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in hiPS-Zellen und anschließender Differenzierung in Podozyten. Diese Podozyten ähneln in vivo Podozyten viel besser in Bezug auf morphologische Merkmale, wie die Entwicklung von Fußfortsätzen und die Expression des Podozyten-spezifischen Markers. Schließlich, aber wichtig, behalten diese Zellen die Mutationen der Patienten bei, was zu einem verbesserten Ex-vivo-Modell führt, um Podozytenerkrankungen und potenzielle therapeutische Substanzen in einem individualisierten Ansatz zu untersuchen.

Mit diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll, das episomale Reprogrammierung und Differenzierung kombiniert, ist es möglich, Podozyten zu erzeugen, die die Mutation eines Patienten in einem Podozyten-relevanten Gen tragen. Dies ermöglicht die Analyse krankheitsspezifischer Podozytenveränderungen ex vivo. Der genetische Hintergrund des Patienten bleibt während des Protokolls in allen verschiedenen Zellstadien erhalten. Darüber hinaus kann die Begrenzung der unzureichenden Zellzahl von terminal differenzierten, nicht-proliferierenden Podozyten durch die Verwendung von hiPSC-abgeleiteten Podozyten überwunden werden. Obwohl es mehrere Monate dauert, bis aus herausgewachsenen dermalen Fibroblasten durch Reprogrammierung in hiPS-Zellen und anschließende Differenzierung in Podozyten hiPS-Podozyten erzeugt werden, ist es möglich, Zellen in drei verschiedenen Schritten des Protokolls einzufrieren (Abbildung 2). Das Einfrieren von Fibroblasten, hiPS-Zellen und Nephron-Vorläuferzellen ist nach Differenzierung in Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium für 7 Tage möglich. Daher ist die Generierung von funktionierenden Zellbanken und groß angelegten Experimenten möglich.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Abbildung 2: Einzelne Schritte des Protokolls durch ein Phasenkontrastmikroskop. (A) Ausgewachsene dermale Fibroblasten. (B) hiPSC-Koloniebildung nach Reprogrammierung. (C) Ausgewählte hiPSC-Kultur. (D) Mesodermzellen nach 2 Tagen Differenzierung. (E) Nephron-Vorläuferzellen nach 14-tägiger Differenzierung in Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium. (F) Terminale differenzierte hiPSC-abgeleitete Podozyten. Maßstabsbalken stellen 300 μm (A,B,D-F) und 150 μm (C) dar. Die Schneeflocke hebt mögliche Gefrierschritte hervor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Da die generierten hiPSC-abgeleiteten Podozyten ein langes Protokoll mit drastischen Veränderungen in Bezug auf Zelltyp und Morphologie durchlaufen, ist eine Zellcharakterisierung obligatorisch. Die Zellmorphologie, wie Größe und Form der Zelle, sowie das Wachstumsverhalten können mit einem Phasenkontrastmikroskop überwacht werden. Fibroblasten weisen einen langen, spindelförmigen Phänotyp mit einer Größe von 150 μm bis 300 μm auf (Abbildung 2A). Nach der Reprogrammierung entstehen Kolonien mit 50 μm kleinen hiPSCs. Diese Kolonien weisen ausgeprägte Ränder und hiPS-Zellen auf, die sich durch ein hohes Zellkern-zu-Körper-Verhältnis und eine erhöhte Proliferationsrate auszeichnen (Abbildung 2C). Da es sich bei Podozyten um terminal differenzierte Zellen handelt, nimmt die Proliferationsrate mit fortschreitender Differenzierung ab, und die Zellmorphologie ändert sich zu 300 μm großen sternförmigen Podozyten mit prominenten Fußfortsätzen (Abbildung 2F).
Die Konfluenz ist ein kritischer Punkt der hiPSC-Kultur, und eine spontane Differenzierung kann auftreten, wenn die Kolonien zu dicht wachsen (Abbildung 3). Diese Kolonien müssen vor dem Durchgang entfernt werden, indem die betroffenen Teile der Kulturschale abgekratzt werden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Abbildung 3: Beispiele für hiPS-Zellen unterschiedlicher Qualität. Phasenkontrastbilder von erfolgreich (A) reprogrammierten hiPSC-Kolonien und (B) selektierten hiPS-Kolonien, sowie (C) spontaner Differenzierung, (D,E) Nicht-hiPSC-Kolonien und (F) einer zu dichten hiPSC-Kultur. Maßstabsbalken stellen 300 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die verschiedenen Zelltypen dieses Protokolls müssen hinsichtlich der Expression eines bestimmten Markers validiert werden. Nach der Reprogrammierung erlangen hiPSCs ihre Pluripotenzkapazität zurück und exprimieren Proliferations- und Pluripotenzmarker wie SSEA4, OCT3/4 und Ki67 (Abbildung 4)38,39,40. Es ist bekannt, dass die Reprogrammierung sowie die langwierige Kultur von hiPS-Zellen und Differenzierung zu einem abnormen Karyotyp führen bzw. Mutationen induzieren können41. Daher sollte der genetische Hintergrund der kultivierten Zellen über die Zeit und an verschiedenen Passagen durch g-Banding und Sequenzierung des gesamten Exoms überwacht werden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Abbildung 4: Charakterisierung der erzeugten hiPS-Zellen mittels Immunfluoreszenzfärbung. Charakterisierung der generierten hiPSCs durch Färbung für (A) den proliferativen Marker Ki67, sowie die Pluripotenzmarker (B) OCT3/4 und (C) SSEA4. Maßstabsbalken stellen 100 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Morphologisch erscheinen hiPSC-abgeleitete Podozyten sternförmig und weisen im Vergleich zu ciPodozyten ein ausgeprägtes Netzwerk langer primärer und sekundärer Fußfortsätze auf (Abbildung 5). Von HiPSC abgeleitete Podozyten exprimieren Podozyten-spezifische Markerproteine wie Synaptopodin, Nephrin und Podocin (Abbildung 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Abbildung 5: Morphologie von hiPSC-abgeleiteten Podozyten im Vergleich zu ciPodozyten. Vergleich von (A,B) hiPSC-abgeleiteten Podozyten eines gesunden Spenders mit (C,D) ciPodozyten hinsichtlich Zellmorphologie und Filopodien unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops (A,C) und eines Rasterelektronenmikroskops (B,D). Maßstabsbalken stellen 150 μm (A,C) und 20 μm (B,D) dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Daher ermöglicht der Vergleich von hiPSC-abgeleiteten Podozyten nicht nur von gesunden Spendern, sondern auch von Patienten mit Mutationen in Podozyten-spezifischen Genen eine individualisierte Charakterisierung der Mutation des Patienten ex vivo.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Abbildung 6: Charakterisierung eines Podozyten-spezifischen Markers in hiPSC-abgeleiteten Podozyten und ciPodozyten. Vergleich von (A-C) hiPSC-abgeleiteten Podozyten eines gesunden Spenders mit (D-F) ciPodozyten hinsichtlich der Podozyten-spezifischen Markerproteine Synaptopodin (A,D), Nephrin (B,E) und Podocin (C,F). Maßstabsbalken stellen 50 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1. Zusammensetzung aller in der Studie verwendeten Zellkulturmedien und -lösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieses Manuskript beschreibt ein zweistufiges Protokoll zur Erzeugung patientenspezifischer Podozyten aus dermalen Fibroblasten durch episomale Reprogrammierung in human-induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) und anschließende Differenzierung in Podozyten.

Generierung von patienteneigenen Podozyten aus Hautbiopsien

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Generierung humaner Podozyten durch episomale Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in human-induzierte pluripotente Stammzellen. Diese Zellen ähneln in vivo Podozyten viel besser als immortalisierten Podozyten in Bezug auf Podozyten-Nahrungsprozesse und die Expression von Podozyten-spezifischen Markern. Podozyten sind terminal differenzierte Zellen.Daher vermehren sich diese Zellen nicht mehr und die primäre Podozytenanalyse in der Zellkultur ist eingeschränkt. Obwohl das Problem der begrenzten Zellzahl durch die Verwendung von bedingt immortalisierten Podozyten überwunden werden konnte, weisen diese Podozyten einen dedifferenzierten Phänotyp und ein dedifferenziertes Verhalten auf, was ihre Verwendung in der Grundlagenforschung in Frage stellt. Mit Hilfe von induzierten pluripotenten Stammzellen können Podozyten in vitro in einer nahezu unbegrenzten Zellzahl mit typischer Podozytenmorphologie einschließlich unterschiedlicher Nahrungsprozesse und der Expression von Podozyten-spezifischen Markern erzeugt werden.Durch die Verwendung der patientenspezifischen Stammzellen zur Differenzierung in Podozyten ist es möglich, die krankheitsspezifischen Veränderungen der Zelle ex vivo zu untersuchen. In diesem Fall wurde die erste Hautbiopsie von einem Patienten mit einer genetisch bedingten Podozytenerkrankung entnommen. Podozyten, die mit unserem Protokoll erzeugt werden, sind personalisierte kranke Zellen, die die Mutation des Patienten tragen.Somit stellen diese Zellen ein verbessertes ex vivo Modell dar, um Podozytenerkrankungen und potentielle therapeutische Substanzen in einem individualisierten Ansatz zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video beschreiben wir das Protokoll zur Ableitung von humanen Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen durch Zelldifferenzierung unter definierten chemischen Bedingungen. Die generierten Podozyten können für Nephrotoxizitätstests und die Modellierung von Krankheiten verwendet werden.

Ableitung humaner Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen: Ein Verfahren zur gerichteten Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus Stammzellen

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein umfassendes und detailliertes Protokoll darüber bereitzustellen, wie genetisch veränderte menschliche organotypische Haut aus epidermalen Keratinozyten und devitalisierter menschlicher Dermis erzeugt werden kann.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (&gt;90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Hier wird ein Protokoll zur Entwicklung eines personalisierten Organ-on-a-Chip-Systems vorgestellt, das die Struktur und Funktion der nierenglomerulären Filtrationsbarriere rekapituliert, indem genetisch angepasste Epithel- und vaskuläre Endothelzellen integriert werden, die sich von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen unterscheiden. Dieses biotechnologisch hergestellte System kann die Nierenpräzisionsmedizin und verwandte Anwendungen voranbringen.

Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für Gewebe aggitation zu einem hohen Volumen von lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf nerual Gewebe erklärt.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet...

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Proteine können entweder eine native Struktur annehmen oder sich in unlösliches Amyloid fehlfalten. Bedingungen, die den Fehlfaltungsweg begünstigen, führen zur Bildung verschiedener Arten von Amyloidfibrillen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine schnelle Umwandlung von nativen Proteinen in Amyloid in vitro.

Schnelle Generierung von Amyloid aus nativen Proteinen in vitro

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Erfahren Sie die episomale Reprogrammierung von Hautfibroblasten zu hiPSCs und deren Differenzierung zu patienteneigenen Podozyten. Diese Methode ermöglicht personalisierte Krankheitsmodelle für die Nephrologieforschung.

Generierung von patienteneigenen Podozyten aus Hautbiopsien

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