Name: Messung von Verstopfung in einem Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie man Verstopfung in einem Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit mit Alpha-Synuclein-Expression misst. Diese einfache Methode erlaubt die Bewertung von Darmtransitzeiten bei Neurodegeneration.

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Wir danken Dr. Mel Feany vom Brigham and Women's Hospital und der Harvard Medical School für das freundliche Geschenk der Kontroll- und Alpha-Synuclein-exprimierenden Drosophila-Linien . Wir danken Dr. Olsen für die folgenden Fördermittel: NINDS K08, George C. Cotzias Fellowship der American Parkinson Disease Association, Parkinson's Disease Early Investigator Award des Verteidigungsministeriums.

In diesem Assay verwendete Fliegen: Kontrolle: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; Alpha-Synuclein-Fliegen: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-Synuclein/+; 1 und 10 Tage nach dem Ausschluss; männliche und weibliche (verpaarte und unverpaarte) Fliegen (siehe Materialtabelle).
1. Zubereitung des gefärbten Fliegenfutters
<ol><li>Mischen Sie blaue Weichgelpaste Lebensmittelfarbe (siehe Materialtabelle) mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1:1 (v/v). HINWEIS: Verwenden Sie handelsübliche Lebensmittelfarbe, die nur nicht resorbierbare Farbstoffe enthält, da einige blaue Farbstoffe nachweislich neuroprotektive Wirkungen haben21.</li>
	<li>Die Fläschchen mit Fliegenfutter, bestehend aus Standard-Maismehl-Agar (siehe Materialtabelle), in Intervallen von 10-15 s in der Mikrowelle erhitzen, bis das Futter zu einer Flüssigkeit oder einem Brei geschmolzen ist. Lassen Sie die Speisen nicht überkochen.</li>
	<li>Geben Sie die Farbstoffmischung in jedes Fläschchen mit Lebensmitteln, um eine gleichmäßige Färbung zwischen den Fläschchen zu erhalten. Mischen Sie die Farbstoffmischung ein, bis das Futter homogen blau ist (Abbildung 1). Fügen Sie eine Menge der blauen Farbstoffmischung hinzu, so dass die Farbe des Lebensmittels gesättigt ist und es keine Farbunterschiede zwischen den Durchstechflaschen gibt. HINWEIS: Dieser Schritt muss kurz nach dem Erhitzen in der Mikrowelle durchgeführt werden, da die Lebensmittel schnell fest werden. Wenn das Essen fest wird, erhitzen Sie die Durchstechflasche erneut in der Mikrowelle.</li>
	<li>Lassen Sie die Fläschchen mit gefärbten Lebensmitteln an der Luft trocknen, bis sie fest werden. Legen Sie während des Trocknens ein dünnes Papiertuch über die Öffnungen der Durchstechflasche, um zu verhindern, dass verirrte Fliegen in der Durchstechflasche landen.</li>
	<li>Sobald das Futter abgekühlt und fest geworden ist, geben Sie die Fliegen, die zum Testen verwendet werden, auf das blaue Futter. HINWEIS: Für schmale Durchstechflaschen (25 mm) wird empfohlen, 9-14 Fliegen in jede Durchstechflasche zu geben. Für breite Fläschchen (28,5 mm) wird empfohlen, 10-20 Fliegen in jedes Fläschchen zu geben. Fliegen werden nicht durch Geschlecht oder Paarungserfahrung getrennt und umfassen eine gemischte Population aus männlichen und weiblichen Fliegen, mit verpaarten und unverpaarten Weibchen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Fläschchen mit Fliegen über Nacht bei 25 °C in einem Inkubator.</li>
</ol>2. Bildgebung der Fliegen
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional (Abbildung 2).
<ol><li>Am nächsten Morgen (Zeit 0) betäuben Sie die repräsentativen Fliegen 60 s lang mit Kohlendioxid. Platzieren Sie die Fliege so, dass die Bauchseite nach oben zeigt.</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer Kamera (siehe Materialtabelle) zu jeder Stunde Bilder der Fliegen auf, um die Menge an blauer Nahrung zu visualisieren, die im Verdauungssystem verbleibt. HINWEIS: Diese Fliegen sollten nicht für den quantitativen Teil des Assays (Schritt 3) verwendet werden, da die Anästhesie die Ergebnisse beeinflussen kann.</li>
	<li>Zu jeder vollen Stunde neue Fliegen anästhesieren und abbilden.</li>
</ol>3. Durchführung des Verstopfungs-Assays
<ol><li>Die verbleibenden (nicht betäubten) Fliegen in Fläschchen mit Standardfutter von Drosophila umfüllen. Nummerieren Sie jede Durchstechflasche.</li>
	<li>Lassen Sie die Fliegen 60 Minuten lang bei 25 °C im Inkubator.</li>
	<li>Nach 60 Minuten werden die Fliegen in neue Fläschchen mit Standard-Drosophila-Futter umgefüllt. Beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung mit dem ersten Satz Fläschchen.</li>
	<li>Ziehen Sie eine gestrichelte Linie entlang der Länge des Fläschchens, um den Punkt zu markieren, an dem die Zählung beginnt.</li>
	<li>Zählen Sie manuell die Anzahl der kleinen, runden Punkte an der Wand jeder Durchstechflasche. Zählen Sie nicht die Punkte, die sich auf dem Stopfen des Futters oder der Durchstechflasche befinden.</li>
	<li>Beginnen Sie damit, die Anzahl der blauen Punkte an der Wand jedes Fläschchens zu zählen.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der undurchsichtigen, farblosen Punkte an der Wand jeder Durchstechflasche. HINWEIS: Jeder Punkt ist Fliegenkot, der eine Kombination aus Urin und Fäkalienist 22. Gelegentlich kann es vorkommen, dass eine Fliege über den Kot läuft und eine Spur hinterlässt. In diesem Fall wird nur der ursprüngliche Punkt gezählt, nicht jede einzelne Markierung in der Spur.</li>
	<li>Notieren Sie das Verhältnis der blauen Punkte zur Gesamtzahl der Punkte für jede Durchstechflasche. HINWEIS: Die Gesamtzahl der Punkte ist die Anzahl der blauen Punkte auf der Wand einer Durchstechflasche, die zur Anzahl der farblosen Punkte auf der Wand derselben Durchstechflasche addiert wird. Dies wird verwendet, um den Prozentsatz der blauen Fäkalien pro Stunde zu berechnen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.8 sieben weitere Male und erfassen Sie stündlich Daten über einen Zeitraum von insgesamt 8 Stunden.</li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Grafisch darstellen Sie den prozentualen Anteil blauer Fäkalien pro Stunde für jede Bedingung.</li>
	<li>Vergleichen Sie die Daten zwischen den Bedingungen. HINWEIS: Die statistische Signifikanz kann auf 3 Arten bestimmt werden: durch den Vergleich einzelner Zeitpunkte zwischen Bedingungen, durch Messen der Steigung der Linie im Zeitverlauf oder durch Vergleichen der Fläche unter der Kurve.</li>
</ol>

Verstopfungstests bei Drosophila-Fliegen

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li>
<li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218(2019).</li>
<li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116(2021).</li>
<li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+style+risks+of+Parkinson%27s+disease%3A+association+between+decreased+water+intake+and+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li>
<li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis%3A+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3(2017).</li>
<li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li>
<li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson%27s+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082(2021).</li>
<li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li>
<li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+gut%3A+symptoms%2C+nutrition%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li>
<li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson%27s+disease+through+the+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54(2022).</li>
<li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKN%2Fparkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li>
<li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestine-derived+%CE%B1-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44(2022).</li>
<li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constipation%2C+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5(2019).</li>
<li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li>
<li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li>
<li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+%CE%B1-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li>
<li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li>
<li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster%3A+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li>
<li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206(2023).</li>
<li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279(2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte, die den erfolgreichen Abschluss des Assays unterstützen. Zunächst muss sichergestellt werden, dass die Zeitintervalle zwischen den einzelnen Runden für jedes Fläschchen während des gesamten Experiments konsistent sind. Die Beschriftung der Fläschchen mit Nummern hilft, langwierige Genotypbeschreibungen zu vermeiden, was Zeit spart. Darüber hinaus ist es entscheidend, dass die Methode zur Zählung von Fäkalien22 während des gesamten Experiments konsistent bleibt. Während blaue Fäkalien auf dem Futter und dem Fläschchenstopfen sichtbar sind, ist dies bei farblosen Fäkalien nicht der Fall. Zählen Sie daher nicht die blauen Punkte auf dem Lebensmittel- oder Fläschchenstopfen.
Bei Verhaltensassays besteht immer die Möglichkeit von Inkonsistenzen in den Ergebnissen aufgrund von Schwankungen im Fliegenverhalten oder unbekannten Variablen, die den Assay beeinflussen. Wir empfehlen, für alle Experimente das gleiche Drosophila-Medium , den gleichen Lebensmittelfarbstoff und die gleiche Marke von Fläschchen zu verwenden. Interessanterweise wurde in mehreren Versuchen beobachtet, dass Fliegen dazu neigen, am frühen Nachmittag seltener zu koten, was möglicherweise auf den zirkadianen Rhythmus der Fliegen zurückzuführenist 23. Dieses Verhalten ist jedoch sowohl bei Kontrollfliegen als auch bei Fliegen, die Alpha-Synuclein exprimieren, konsistent und sollte daher keinen Anlass zur Sorge geben.
Wenn die Fliegen zu Beginn des Assays keine blauen Fäkalien ausscheiden, ist es möglich, dass der verwendete Farbstoff nicht ausreichend pigmentiert ist. In diesem Fall kann man das Verhältnis von Farbstoff zu destilliertem Wasser entsprechend erhöhen. Es ist auch möglich, dass es schwierig sein kann, festzustellen, ob der Kot blassblau oder farblos ist, wenn nur noch eine kleine Menge blauer Nahrung im Verdauungstrakt der Fliege vorhanden ist. In diesem Fall können Sie ein weißes Blatt Papier hinter die Durchstechflasche legen, um die Farbe des Fäkalienpunkts zu bestimmen. Auch wenn die Fäkalien sehr hellblau sind, ist es am besten, sie als blaue Fäkalien und nicht als farblose Fäkalien zu erfassen.
Eine Einschränkung dieses Assays besteht darin, dass die Kotflecken manuell gezählt werden müssen. Um das Potenzial für das Hochdurchsatz-Screening zu verbessern, könnte dieses Protokoll in Zukunft modifiziert werden, um eine automatisierte Quantifizierung von blauen Kotflecken zu ermöglichen, die von einzelnen Fliegen in Multi-Well-Platten produziert werden. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass das Alpha-Synuclein-Modell zwar das Potenzial hat, zu einem Prodromalmodell der Parkinson-Krankheit entwickelt zu werden, aber noch kein optimaler Zeitpunkt identifiziert wurde, zu dem eine Verstopfung ohne Neurodegeneration vorliegt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode einen einfachen, unkomplizierten Ansatz zur Modellierung von Verstopfung, einem wenig untersuchten nicht-motorischen Parkinson-Symptom, in einem Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit bietet.

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die klinisch durch das Vorhandensein von motorischen Symptomen wie Bradykinesie, Steifheit und Tremor gekennzeichnet ist, was zu einer signifikanten Morbidität führt1. Pathologisch wird Parkinson durch den Verlust von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra und die Fehlfaltung von Alpha-Synuclein definiert, was zur Bildung von Lewy-Körperchen und Lewy-Neuriten führt. Die Pathogenese der Parkinson-Krankheit ist nach wie vor unzureichend verstanden, was wahrscheinlich auf ein komplexes Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren zurückzuführenist 2,3. Derzeit sind krankheitsmodifizierende Therapien nicht verfügbar, was möglicherweise zum Teil auf das fortgeschrittene Stadium der Pathologie zum Zeitpunkt der Diagnose zurückzuführen ist. Studien haben gezeigt, dass mehr als 60 % der dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra bereits durch das Auftreten motorischer Symptome verloren gegangen sind, was die Notwendigkeit unterstreicht, potenzielle Biomarker für die Früherkennung von Krankheiten zu erforschen4. Ein solcher klinischer Biomarker ist die Verstopfung, die bei Parkinson-Patienten häufig auftritt 5,6 und dem Beginn der motorischen Symptome Jahre oder sogar Jahrzehnte vorausgehen kann.
Trotz der klinischen Definition der Parkinson-Krankheit, die auf motorischen Symptomen basiert, ist Verstopfung eines von mehreren nicht-motorischen Symptomen, die symptomatisch schwieriger zu behandeln sind und eine erhebliche Beeinträchtigung der Lebensqualität der Patienten verursachen7. Veränderungen in der Darm-Hirn-Achse, die die bidirektionale Kommunikation zwischen dem Gehirn und dem enterischen Nervensystem darstellt, wurden mit der Parkinson-Pathogenese in Verbindung gebracht. Alpha-Synuclein-Aggregate wurden in Gewebeproben aus dem Magen-Darm-Trakt von Parkinson-Patienten gefunden8, und Tiermodelle deuten darauf hin, dass sich Alpha-Synuclein-Aggregate im enterischen Nervensystem prionenartig auf das zentrale Nervensystem ausbreiten9. Darüber hinaus weisen Parkinson-Patienten Anomalien im Darmmikrobiomauf 10 und können eine übermäßige Darmentzündung erleiden11. Verstopfung bei Parkinson wurde bisher zu wenig untersucht, wobei nur wenige Modelle von Parkinson-assoziierter Verstopfung bei Fliegen 12,13 oder Nagetieren berichtet wurden14,15.
Dieser Assay verwendet ein Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit, in dem Fliegen das menschliche Alpha-Synuclein-Gen unter der Kontrolle eines panneuronalen Treibers, n-Synaptobrevin, exprimieren. Diese Fliegen weisen alle charakteristischen Merkmale der Parkinson-Krankheit auf, einschließlich Alpha-Synuclein-Aggregation, motorischer Dysfunktion und altersbedingter Neurodegeneration, was zum Verlust von dopaminergen Neuronen führt16,17. Frühere Studien haben die Messung der Kotausscheidung bei Fliegen eingeführt, um die Darmdysfunktion zu beurteilen, Fliegenkot zu quantifizieren und die Ausscheidungsmengen über verschiedene genetische Linien hinweg zu vergleichen, um funktionelle Unterschiede im Verdauungssystem aufzudecken 18,19,20. Hier demonstrieren wir den Verstopfungs-Assay mit Fliegen, die menschliches Alpha-Synuclein exprimieren. Dieses einfache, aber wertvolle Werkzeug ermöglicht die Untersuchung eines wichtigen nicht-motorischen Symptoms der Parkinson-Krankheit.

<table><tbody><tr><td>1400 g Saccharose</td><td>MP Biomedicals</td><td>904713</td><td></td></tr><tr><td>1800 g Dextrose</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td></td></tr><tr><td>2884 g Hefe</td><td>MP Biomedicals</td><td>903312</td><td></td></tr><tr><td>428 g Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>10253156</td><td></td></tr><tr><td>4600 mL Melasse</td><td>Grandma's Melasses</td><td>7971942</td><td></td></tr><tr><td>68 L Wasser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>680 mL Tegosept Mix (1200 g Tegosept in 6 L Ethanol)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6864 g</td><td>Maismehl Pearl Milling</td><td>125045</td><td></td></tr><tr><td>800 mL Acid Mix (83 mL Phosphorsäure in 1 L Wasser + 836 mL Propionsäure in 1 L Wasser)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Standardsoftware</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-Aper</td><td>111ACS200</td><td></td></tr><tr><td>Flügel für breite Kunststofffläschchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff breite Drosophila-Fläschchen, Polystyrol</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>Version 9.5.1</td></tr><tr><td>Olympus DP23 Kamera</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX12 Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25470A</td><td></td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A258 - 500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Weichgelpaste Lebensmittelfarbe, Königsblau</td><td>AmeriColor</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td><td>Alle Linien von Dr. Mel Feany</td><td>N/A</td><td>Linien sind direkt bei Dr. Feany erhältlich&nbsp;</td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-Synuclein</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

messung von verstopfung in einem drosophila-modell der parkinson-krankheit

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

Nicht-motorische Symptome bei der Parkinson-Krankheit (PD) sind häufig, schwer zu behandeln und beeinträchtigen die Lebensqualität erheblich. Ein weit verbreitetes nicht-motorisches Symptom ist Verstopfung, die der Diagnose von Parkinson Jahre oder sogar Jahrzehnte vorausgehen kann. Verstopfung wurde in Tiermodellen für Parkinson zu wenig erforscht und es fehlen spezifische Therapien. Dieser Assay verwendet ein Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit, in dem humanes Alpha-Synuclein unter einem panneuronalen Treiber exprimiert wird. Fliegen, die Alpha-Synuclein exprimieren, entwickeln die charakteristischen Merkmale von Parkinson: den Verlust von dopaminergen Neuronen, motorische Beeinträchtigungen und Alpha-Synuclein-Einschlüsse.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von Verstopfung bei diesen Fliegen. Die Fliegen werden über Nacht auf Fliegenfutter mit einem blauen Farbzusatz gesetzt und dann am nächsten Tag auf Standardfutter umgestellt. Anschließend werden sie 8 Stunden lang stündlich in neue Fläschchen mit Standard-Fliegenfutter umgefüllt. Vor jedem Transfer wird der prozentuale Anteil der blau gefärbten Kotflecken im Vergleich zu den gesamten Kotflecken an der Fläschchenwand berechnet. Kontrollfliegen, denen Alpha-Synuclein fehlt, stoßen den gesamten blauen Farbstoff Stunden vor den Fliegen aus, die Alpha-Synuclein exprimieren. Darüber hinaus kann die Passage von blau gefärbter Nahrung aus dem Darm mit einfacher Fotografie überwacht werden. Die Einfachheit dieses Assays ermöglicht seine Verwendung in genetischen oder chemischen Screenings zur Identifizierung von Modifikatoren der Verstopfung in Drosophila.

Da der Hinterleib von Drosophila durchsichtig ist, kann blaue Nahrung im Darm von lebenden betäubten Fliegen sichtbar gemacht werden. Qualitative Unterschiede in der Darmpassage können durch Aufnahmen der Fliegen zu verschiedenen Zeitpunkten beurteilt werden. Bei Kontrollfliegen wird die blaue Nahrung schnell ausgeschieden, während bei Alpha-Synuclein-Fliegen die blaue Nahrung bis zu 8 Stunden im Darm vorhanden bleibt (Abbildung 2).
Die Alpha-Synuclein-Fliegen weisen eine altersbedingte Neurodegeneration auf, wobei sich 10 Tage nach der Exklusion ein robuster Phänotyp entwickelt10. Zu diesem Zeitpunkt werden Unterschiede in der Darmtransitzeit im Vergleich zu Kontrollfliegen durch den Vergleich einzelner Zeitpunkte zwischen Bedingungen, durch Messung der Steigung der Linie im Laufe der Zeit oder durch Vergleich der Fläche unter der Kurve festgestellt (Abbildung 3). Es wurden keine Unterschiede in der Darmpassage zwischen Kontroll- und Alpha-Synuclein-Fliegen zu einem früheren Zeitpunkt, Tag 1 nach der Exlosion, beobachtet, wenn auch keine motorische Dysfunktion und Neurodegeneration vorhanden sind (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Blaue Fläschchen und Kotflecken. (A) Alle Fläschchen enthalten blau gefärbte Lebensmittel. Zu diesem Zeitpunkt sind die Fliegen gerade erst mit dem blauen Futter in Berührung gekommen, und es sind keine blauen Fäkalien zu sehen. (B) Ein Fläschchen, nachdem w1118 Fliegen 1 h lang in frisches Futter überführt und dann entfernt wurden. Der linke Einschub wird in (C) und der rechte Einschub in (D) vergrößert. (C) Ein Gebiet, das aufgrund des Vorhandenseins von Fliegenfutter von der Analyse ausgeschlossen ist. (D) Vergrößerte Ansicht der Kotflecken mit blauen (schwarze Pfeile) und nicht-blauen Flecken (gelbe Pfeile). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> Abbildung 2: Visualisierung der Darmpassage der gefärbten Lebensmittel im Laufe der Zeit. Kontrollfliegen und Fliegen, die menschliches Alpha-Synuclein in Neuronen exprimierten, wurden über Nacht auf blau gefärbtem Futter belassen und dann am nächsten Tag auf Standardmedien übertragen. Die Fliegen wurden stündlich auf neues Standard-Fliegenfutter umgestellt. Es werden repräsentative Bilder zum Zeitpunkt Null und 2, 4, 6 und 8 Stunden nach der Übertragung angezeigt. Kontroll- und Alpha-Synuclein-Fliegen zeigen zum Zeitpunkt Null ähnliche Flecken blauer Nahrung im Darm. Zu den folgenden Zeitpunkten haben Kontrollfliegen weniger blaue Nahrung als Alpha-Synuclein-Fliegen, und alle blaue Nahrung ist zum 8-Stunden-Zeitpunkt bei Kontrollfliegen verschwunden. Die Genotypen für jede Fliegenschnur sind wie folgt: Kontrolle (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); Alpha-Synuclein-Fliegen (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-Synuclein/+). Weibliche Fliegen werden für die Bildgebung verwendet, da sie aufgrund ihrer größeren Größe den Hinterleib leichter visualisieren können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Verstopfungstest an Tag 10 nach der Exlosion. Kontrollfliegen und Fliegen, die menschliches Alpha-Synuclein in Neuronen exprimierten, wurden über Nacht auf blau gefärbtem Futter belassen und dann am nächsten Tag auf Standard-Fliegenfutter umgestellt. Die Fliegen wurden stündlich seriell auf neue Standardmedien übertragen. (A) Prozent blaue Fäkalien pro Stunde. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung dar. N = 6 Fläschchen pro Genotyp; Jedes Fläschchen enthielt 9-14 Fliegen. Alle statistischen Analysen wurden in Graphpad Prism durchgeführt (siehe Materialtabelle). Die statistische Signifikanz zu jedem Zeitpunkt wurde mit Hilfe der Zwei-Wege-ANOVA berechnet. Die Steigung der Linie und die Differenz zwischen den Steigungen wurden mit Hilfe der linearen Regressionsanalyse berechnet. (B) Die Fläche unter der Kurve wurde für jeden Genotyp berechnet. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung dar. Die Genotypen für jede Fliegenschnur sind wie folgt: Kontrolle (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); Alpha-Synuclein-Fliegen (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-Synuclein/+). Sowohl männliche als auch weibliche Fliegen sind in etwa gleicher Anzahl enthalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Verstopfungstest bei Tag-1-Fliegen nach der Exlosion. Kontrollfliegen und Fliegen, die menschliches Alpha-Synuclein in Neuronen exprimierten, wurden über Nacht auf blau gefärbtem Futter belassen und dann am nächsten Tag auf Standardmedien übertragen. Die Fliegen wurden stündlich auf neues Standard-Fliegenfutter umgestellt. (A) Prozent blaue Fäkalien pro Stunde. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung dar. N = mindestens 5 Durchstechflaschen pro Genotyp; Jedes Fläschchen enthielt 9-14 Fliegen. Alle statistischen Auswertungen wurden in Graphpad Prism durchgeführt. Die statistische Signifikanz zu jedem Zeitpunkt wurde mit Hilfe der Zwei-Wege-ANOVA berechnet. Die Steigung der Linie und die Differenz zwischen den Steigungen wurden mit Hilfe der linearen Regressionsanalyse berechnet. (B) Die Fläche unter der Kurve wurde für jeden Genotyp berechnet. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung dar. Die Genotypen für jede Fliegenschnur sind wie folgt: Kontrolle (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); Alpha-Synuclein-Fliegen (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-Synuclein/+). Sowohl männliche als auch weibliche Fliegen sind in etwa gleicher Anzahl enthalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll stellt einen Assay zur Modellierung von Verstopfung in einem Alpha-Synuclein-basierten Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit vor.

Messung von Verstopfung in einem Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

Die Parkinson-Krankheit wird durch die motorischen Symptome Bradykinesie, Tremor und Rigidität definiert. Viele Parkinson-Patienten leiden jedoch unter nicht-motorischen Symptomen, die schwieriger zu behandeln sind und eine größere Beeinträchtigung der Lebensqualität verursachen. Diese wurden in Tiermodellen der Krankheit nicht gut untersucht, was unsere Möglichkeiten einschränkt, neue Therapien für sie zu finden.Dieses Protokoll ist einfach und kostengünstig, erzeugt aber reproduzierbare Ergebnisse. Es ist leicht zu erlernen und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Mit diesem einfachen Assay können wir Verstopfung bei Fliegen mit Neurodegeneration beurteilen.In Zukunft hoffen wir, ein Modell zu entwickeln, bei dem Fliegen Verstopfung entwickeln, bevor die Neurodegeneration einsetzt. Dies wird es uns ermöglichen, die Pathogenese der Parkinson-Krankheit besser zu verstehen.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Behavior-Assays zur Messung der lokomotorischen Funktionen, Lern-und Gedächtnisleistung...

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die aus der Degeneration der dopaminergen Neuronen im Zentralnervensystem führt, wodurch Bewegungsfehler. Rotenon Modellen der Parkinson-Krankheit in Drosophila. In diesem Dokument werden zwei Tests, die sowohl spontan als auch erschrecken-induzierten Bewegungsmangel durch Rotenon verursacht charakterisieren.

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Wir präsentieren einen optimierten, kostengünstigen und zuverlässigen negativen Geotaxis-Assay in Drosophila melanogaster als Modell für neurodegenerative Erkrankungen. Da dieser Assay empfindlicher auf leichte Defekte des Bewegungsapparates reagiert, hilft er bei der Suche nach potenziellen genetischen Wechselwirkungen und Wirkstoffzielen.

Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

In diesem Artikel zeigen wir, wie man ein Sieben-Punkte-Scoring-System verwendet, um Veränderungen der dopaminergen Neuronen-Dendritenmorphologie bei C. eleganskonsistent zu quantifizieren. Dieses System ist für die Analyse dopaminerger Neurodegenerationsassays unter Verwendung genetischer, chemischer und altersbasierter Modelle neurodegenerativer Erkrankungen vorgesehen.

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Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Defäkationstest bei jungen RAC1/CED-10-mutierten Caenorhabditis elegans und bietet ein einfaches Modell zur Untersuchung der prodromalen Parkinson-Stadien. Es überwindet die Einschränkungen anderer Tiermodelle und erleichtert die Erprobung therapeutischer Strategien, die auf frühe Parkinsonsche Pathologie abzielen.

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Messung von Verstopfung in einem Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit

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