Name: im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung der Reaktion von Neuronen der Spinalganglien auf somatische und viszerale Reize (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Kalzium-Bildgebung von L6-Dorsalwurzelganglion-Neuronen bei somatischen und viszeralen Reizen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen neuronaler Aktivität und liefert Einblicke in Schmerzmechanismen sowie Akupunkturwirkungen.

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Diese Studie wurde vom National Key R&D Program of China (Nr. 2022YFC3500702), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82230123, 82174281) finanziert.

Dieses Tierprotokoll wurde von den Ethikkommissionen für Tierpflege und -verwendung des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der Chinesischen Akademie der Chinesischen Medizinischen Wissenschaften genehmigt und entsprach dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren, um minimale Tiernutzung und Unannehmlichkeiten zu gewährleisten. Pirt-cre-Mäuse wurden freundlicherweise von Dr. Xinzhong Dong von der Johns Hopkins University (Baltimore, MD) gespendet. Rosa26-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). Das folgende Verfahren ist für beide Geschlechter von Mäusen mit einem Gewicht von 20-35 g optimiert. Das empfohlene Alter für Mäuse, die sich der Operation unterzogen, lag zwischen 8 und 14 Wochen. Entweder genetisch kodierte Calciumindikatoren (GECIs), wie z.B. Pirt-GCaMP6s-Mäuse, oder normale C57-Mäuse, die intrathekal mit viralen GECIs injiziert wurden, wurden verwendet, um die Hauptpopulationen von DRG-Neuronen zu zeigen. Gentechnisch veränderte Mäuse, die intrathekal mit viralen GECIs injiziert oder mit Rosa26-GCaMP-Mäusen gekreuzt wurden, würden die spezifische Population von DRG-Neuronen zeigen. Während des gesamten Protokolls wurden Laborkittel, Handschuhe und Masken getragen. Nach dem Experiment wurden die Mäuse mit einer CO2 -Inhalation und anschließender Zervixluxation euthanasiert.
1. Präoperative Einrichtung
<ol>
	<li>Vergewissern Sie sich, dass das Anästhesiebeatmungsgerät (siehe Materialtabelle) ordnungsgemäß installiert wurde.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) vorgeöffnet wurde und ordnungsgemäß funktioniert. 
	HINWEIS: Die Operation und die bildgebenden Verfahren wurden nacheinander durchgeführt, während der Analyseprozess später offline abgeschlossen werden kann.</li>
</ol>
2. Anästhesierung
<ol>
	<li>Intraperitoneal injizieren Sie der Maus eine Tribromethanollösung (1,25%, 250 mg/kg, siehe Materialtabelle)13,14,15. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Rasieren Sie die Haare im unteren Rückenbereich und im ventralen Halsbereich.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in Rückenlage auf das Heizkissen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen zu verhindern. 
	HINWEIS: Die Narkosetiefe wurde so lange beibehalten, wie die Maus während aller chirurgischen und aufzeichnungstechnischen Eingriffe keine Reaktion auf ein Einklemmen der Hinterpfote zeigte. Wenn das Tier Anzeichen von Schmerzen zeigte, wurden zusätzlich 0,2 ml Tribromethanollösung intraperitoneal verabreicht oder 0,5 % Isofluran intratracheal verabreicht, nachdem das Beatmungsgerät angelegt wurde, um Muskelzuckungen zu verhindern und die Narkosetiefe zu gewährleisten.</li>
</ol>
3. Tracheotomie
<ol>
	<li>Machen Sie mit einer chirurgischen Klinge einen Schnitt von ca. 2 cm in der Mittellinie in der Haut des Rachens vom Brustbein bis zum Kinn.</li>
	<li>Verlängern Sie den Schnitt und schieben Sie die Unterkieferdrüsen vorsichtig zur Seite, um sicherzustellen, dass die unter den Drüsen befindlichen Digastricus-Muskeln, die in Längsrichtung entlang der Mitte der Luftröhre verlaufen, vollständig freigelegt werden.</li>
	<li>Sobald die Naht der paratrachealen Muskulatur in der Mitte der Muskeln zu sehen ist, legen Sie die Luftröhre frei, indem Sie die Muskulatur sanft trennen und aufziehen.</li>
	<li>Einen Querschnitt an der Luftröhre anlegen, groß genug, um die zur Lunge gerichtete Luftröhre (Außendurchmesser 1,3 mm, Länge 13 mm, mit einem Y-Adapter, siehe Materialtabelle) aufzunehmen (Abbildung 1A).</li>
	<li>Bedecken Sie die Luftröhre mit den paratrachealen Muskeln und den Unterkieferdrüsen und nähen Sie dann das umgebende Gewebe Schicht für Schicht mit 5-0 chirurgischen Nähten an die Haut.</li>
</ol>
4. Freilegung der Lendenwirbel
<ol>
	<li>Legen Sie das Tier in Bauchlage auf das Heizkissen.</li>
	<li>Legen Sie einen Mittellinienschnitt von ca. 7 cm im unteren Rücken an, der sich vom Lendenwirbel 5 bis zum Sakralwirbel 1 erstreckt.</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig die Dornfortsätze der drei Wirbel frei, indem Sie die Muskeln des Longissimus lumborum zur Seite schieben.</li>
	<li>Legen Sie die drei aufeinanderfolgenden Gelenkfortsätze und Mamillarfortsätze frei, wobei sich das Aufzeichnungssegment in der Mitte der Wirbel befindet, indem Sie die inneren Teile des beidseitigen Longissimus lumborum, der dorsalen Halswirbelsäulenmuskulatur und der dorsalen zervikalen Halbwirbelsäulenmuskulatur beiseite schieben (Abbildung 1B). 
	HINWEIS: Die Gelenkfortsätze und die Mamillarfortsätze der drei Wirbel wurden freigelegt, damit die Wirbelsäulenklemme das Tier während der Aufzeichnung ohne Verschiebung sichern konnte.</li>
</ol>
5. Freilegung des Spinalganglions
<ol>
	<li>Fixieren Sie das Tier sicher mit einer Zahnzange (siehe Materialtabelle) an den beidseitigen Gelenkfortsätzen der benachbarten Wirbel. Verwenden Sie dann eine Rongeur-Pinzette, um entweder den linken oder rechten Gelenk- und Brustfortsatz der Lendenwirbel 6 zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie das linke oder rechte lumbale 6 DRG vorsichtig frei, nachdem Sie das Bindegewebe darüber entfernt haben, und belassen Sie das intakte Epineurium auf der linken oder rechten Seite des lumbalen 6-Wirbels.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die aktiven Bedingungen des exponierten DRG erfüllt sind, indem Sie die exponierten Bereiche mit kleinen, in Kochsalzlösung getränkten Wattebällchen abdecken. 
	HINWEIS: Wechseln Sie die Wattebäusche, bis kein subtiler Blutaustritt in der Nähe des freiliegenden DRG und des umgebenden Gewebes auftritt, da dies die klare Bildgebung der DRG-Neuronen beeinträchtigen könnte. Ersetzen Sie die mit Kochsalzlösung benetzten kleinen Wattebällchen, bis keine roten oder gelben Gewebeflüssigkeiten mehr austreten.</li>
</ol>
6. Immobilisierung und Beatmung
<ol>
	<li>Legen Sie das Tier mit dem freiliegenden lumbal-6 DRG auf ein Heizkissen auf der Bühne einer angepassten Wirbelsäulenklemme16,17 (Abbildung 1C).</li>
	<li>Sichern Sie das Tier mit zwei Klammern an den Wirbelsäulen der benachbarten Wirbel, um die Bewegung während des Tests zu minimieren (Abbildung 1D).</li>
	<li>Wechseln Sie die mit Kochsalzlösung benetzten Wattebällchen weiter, bis der Operationsbereich ausreichend sauber ist (Abbildung 1E).</li>
	<li>Überwachen Sie die Beatmung und die Pulsoximetrie während des gesamten Experiments. 
	HINWEIS: Immobilisieren Sie die Wirbelsäulen mit der individuell angefertigten Wirbelsäulenklemme und stellen Sie dann den Winkel des Polsters so ein, dass das Objektiv des Mikroskops senkrecht zum DRG steht. Nehmen Sie die erforderlichen Einstellungen vor, um das Objektiv und das DRG mit Hilfe von Winkelverstellern auszurichten.</li>
</ol>
7. Hardware- und Software-Setup für die Bildgebung
<ol>
	<li>Setzen Sie die kundenspezifische Wirbelsäulenklemme in den speziell angefertigten Mikroskoptisch ein (Abbildung 1F,G).</li>
	<li>Positionieren Sie eine Luftobjektivlinse mit 10x/0,32 Arbeitsabstand eines konfokalen Mikroskops (siehe Materialtabelle) über dem belichteten DRG für die Bildgebung (Abbildung 1G).</li>
	<li>Erfassen Sie Zeitraffer-Z-Stacks des intakten L-6 DRG mit einer Auflösung von 25 μm/Schritt und einer Auflösung von entweder 512 x 512 oder 1024 x 1024 Pixeln. Die Dauer eines Stapelscans des gesamten DRG variiert zwischen 5 und 15 s, abhängig von Faktoren wie der Rechtwinkligkeit der Position des DRG zur Objektive, der Tiefe und Geschwindigkeit jedes Scanschritts und der Bildauflösung.</li>
	<li>Führen Sie XYZT-Scans des DRG mit 4-8 Stapeln durch, die 1-3 Ausgangszustände, 2-3 Akupunktur- oder viszerale kolorektale Dehnungsstimuli (CRD) und 1-2 Nachstimulizustände enthalten.</li>
</ol>
8. Akupunktur/viszerale Reize und Bildgebung
<ol>
	<li>Wenden Sie Putz- oder Kneifreize auf den unteren Rücken, die Hintergliedmaßen oder die Hinterpfoten des Tieres an, um das empfindlichste rezeptive Feld der abgebildeten DRG-Neuronen zu beurteilen (Abbildung 1H).</li>
	<li>Verabreichen Sie Akupunkturreize manuell oder mit einem handelsüblichen Akupunkturpunkt und Nervenstimulator (Abbildung 1F) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Induktion viszeraler Reize durch Verwendung der kolorektalen Dehnung (CRD) mit einem selbstgebauten Luftdruckmessgerät (Abbildung 1H). 
	HINWEIS: Testen Sie das empfindlichste rezeptive Feld der abgebildeten DRG-Neuronen durch Bürsten oder Kneifen der rezeptiven Bereiche des lumbal-6 DRG. Wenn diese Stimuli während der XYZT-Stack-Aufzeichnung Fluoreszenzänderungen verursachen, wählen Sie Akupunkturpunkte in diesen Bereichen aus, z. B. den unteren Rückenakupunktpunkt BL25 (Dachangshu)18. Wählen Sie Akupunkturpunkte (wie in Abbildung 2 gezeigt), die die Haut und den Muskel innerhalb des rezeptiven Feldes der lumbal-6-Innervation haben.</li>
</ol>
9. Datenanalyse und -verarbeitung
<ol>
	<li>Beurteilen Sie evozierte Kalziumreaktionen mit einem konfokalen Mikroskop, indem Sie die Zunahme der grünen Fluoreszenz des neuronalen GCaMP bei Bindung an intrazelluläres Kalzium nach somatischen oder viszeralen Reizen messen.</li>
	<li>Manuelle Verfolgung sichtbarer Zellen und Bestimmung der Zellgröße und relativen Fluoreszenzintensität mit der Bildgebungssoftware (Fidschi, siehe Materialtabelle). Definieren Sie kleine, mittlere und große Neuronen mit Soma-Durchmessern von <20 μm, 20 bis 30 μm bzw. >30 μm, basierend auf früheren Studien17,19.</li>
	<li>Die Fluoreszenzintensität wird als Verhältnis des Anstiegs der maximal evozierten Fluoreszenz zum Basalniveau (ΔF/F0) oder als Verhältnis der maximal evozierten Fluoreszenz zum Basalniveau (Ft/F0) ausgedrückt, wobei F0 die maximale Fluoreszenzintensität darstellt, die während der Basisperiode gemessen wurde.</li>
	<li>Messen Sie den Prozentsatz der aktivierten Neuronen und die Intensität der evozierten Kalziumtransienten, um Veränderungen der neuronalen Reaktionsfähigkeit nach somatischen oder CRD-Reizen zu beurteilen.</li>
	<li>Definieren Sie die Aktivierung einer Zelle als eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität (ΔF) ≥30 % des Ausgangswerts (F0). 
	HINWEIS: Bevor Sie sichtbare Zellen nachzeichnen, stellen Sie die Helligkeit der Bilder auf den maximalen Wert ein, um die Identifizierung von Zellgrenzen zu erleichtern. Verfolgen Sie keine Zellen, wenn Unsicherheiten bestehen. Überprüfen Sie den aufgenommenen Film vorwärts und rückwärts, um sicherzustellen, dass keine Zellen übersehen werden.</li>
</ol>

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

<ol><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+tactile+acuity+in+chronic+low+back+pain+is+linked+with+structural+neuroplasticity+in+primary+somatosensory+cortex+and+is+modulated+by+acupuncture+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Reduced tactile acuity in chronic low back pain is linked with structural neuroplasticity in primary somatosensory cortex and is modulated by acupuncture therapy.</a> Neuroimage. 217, 116899(2020).</li>
<li>Wei, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+activates+inhibitory+neural+circuits+in+the+somatosensory+cortex+to+relieve+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture activates inhibitory neural circuits in the somatosensory cortex to relieve neuropathic pain.</a> iScience. 24 (2), 102066(2021).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Referred+somatic+hyperalgesia+mediates+cardiac+regulation+by+the+activation+of+sympathetic+nerves+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Referred somatic hyperalgesia mediates cardiac regulation by the activation of sympathetic nerves in a rat model of myocardial ischemia.</a> Neuroscience Bulletin. 38 (4), 386-402 (2022).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+hypersensitivity+as+an+indicator+of+visceral+inflammation+via+c-nociceptor+axon+bifurcation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cutaneous hypersensitivity as an indicator of visceral inflammation via c-nociceptor axon bifurcation.</a> Neuroscience Bulletin. 37 (1), 45-54 (2021).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+population+of+dorsal+root+ganglion+neurons+unravels+novel+mechanisms+of+visceral+pain+sensitization+and+referred+somatic+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in population of dorsal root ganglion neurons unravels novel mechanisms of visceral pain sensitization and referred somatic hypersensitivity.</a> Pain. 162 (4), 106801081(2021).</li>
<li>Huang, T. Y., Belzer V Fau - Hanani, M., Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+dorsal+root+ganglia%3A+possible+contribution+to+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in dorsal root ganglia: possible contribution to visceral pain.</a> European Journal of Pain. 14 (1), 49.e1-49.e11 (2010).</li>
<li>Wang, Y. L., Su, Y. S., He, W., Jing, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+relieved+visceral+and+referred+hindpaw+hypersensitivity+in+colitis+rats+by+inhibiting+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+sixth+lumbar+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture relieved visceral and referred hindpaw hypersensitivity in colitis rats by inhibiting tyrosine hydroxylase expression in the sixth lumbar dorsal root ganglia.</a> Neuropeptides. 77, 101957(2019).</li>
<li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+diminishes+P2X2+and+P2X3+purinergic+receptor+expression+in+dorsal+root+ganglia+of+rats+with+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture diminishes P2X2 and P2X3 purinergic receptor expression in dorsal root ganglia of rats with visceral hypersensitivity.</a> Neural Regeneration Research. 8 (9), 802-808 (2013).</li>
<li>Spencer, N. J., Hibberd, T. J., Lagerström, M., Otsuka, Y., Kelley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+pain+-+Novel+approaches+for+optogenetic+control+of+spinal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visceral pain - Novel approaches for optogenetic control of spinal afferents.</a> Brain Research. 1693 (Pt B), 159-164 (2018).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+single-fiber+recording+and+intact+dorsal+root+ganglion+with+attached+sciatic+nerve+to+examine+the+mechanism+of+conduction+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure.</a> Journal of Visualized Experiments. 150, e59234(2019).</li>
<li>Ma, C., Nie, H., Gu, Q., Sikand, P., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+responses+of+cutaneous+C-mechanosensitive+neurons+in+mouse+to+punctate+chemical+stimuli+that+elicit+itch+and+nociceptive+sensations+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo responses of cutaneous C-mechanosensitive neurons in mouse to punctate chemical stimuli that elicit itch and nociceptive sensations in humans.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (1), 357-363 (2012).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neuroscience Bulletin. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Yao, L., Ye, Q., Liu, Y., Yao, S., Yuan, S., Xu, Q., Deng, B., Tang, X., Shi, J., Luo, J., Wu, J., Wu, Z., Liu, J., Tang, C., Wang, L., Xu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+improves+swallowing+function+in+a+post-stroke+dysphagia+mouse+model+by+activating+the+motor+cortex+inputs+to+the+nucleus+tractus+solitarii+through+the+parabrachial+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture improves swallowing function in a post-stroke dysphagia mouse model by activating the motor cortex inputs to the nucleus tractus solitarii through the parabrachial nuclei.</a> Nat Commun. 14 (1), 810 PMID: 36781899; PMCID: PMC9925820 (2023).</li>
<li>Tian, D., Liu, B., Huang, S., Shi, W., Tian, Y., Yang, Y., Zhang, D., Zhang, Z., Bu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+Ileus+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postoperative Ileus Murine Model.</a> J Vis Exp. (209), PMID: 39072642 (2024).</li>
<li>Zhu, X., Li, C., Afridi, S. K., Zu, S., Xu, J. W., Quanquin, N., Yang, H., Cheng, G., Xu, Z. E90 subunit vaccine protects mice from Zika virus infection and microcephaly. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+X+%22Acta+Neuropathol+Commun%22">Acta Neuropathol Commun</a>. 6 (1), 77 PMID: 30097059; PMCID: PMC6086021 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+cluster+firing%2C+a+distinct+form+of+sensory+neuron+activation%2C+drives+spontaneous+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain.</a> Neuron. 110 (2), 209-220 (2022).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12+receptor+as+a+new+target+for+electroacupuncture+relieving+comorbidity+of+visceral+pain+and+depression+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">P2Y12 receptor as a new target for electroacupuncture relieving comorbidity of visceral pain and depression of inflammatory bowel disease.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 139(2021).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron-specific+GPCR+Mrgprs+are+itch+receptors+mediating+chloroquine-induced+pruritus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus.</a> Cell. 139 (7), 1353-1365 (2009).</li>
<li>Chen, G. S., Su, X. L., Liu, Q., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+moxibustion+in+treatment+of+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Acupuncture-Moxibustion%22%5BJournal%5D)">Research progress of moxibustion in treatment of irritable bowel syndrome.</a> World Journal of Acupuncture-Moxibustion. 31 (02), 136-140 (2021).</li>
<li>Scanziani, M., MHäusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+descending+facilitation+of+spinal+sensory+excitatory+transmission+from+the+anterior+cingulate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Top-down descending facilitation of spinal sensory excitatory transmission from the anterior cingulate cortex.</a> Nature Communications. 9 (1), 1886(2018).</li>
<li>Cartarozzi, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+motoneurons+and+adjacent+glia+in+the+ventral+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of motoneurons and adjacent glia in the ventral spinal cord.</a> Journal of Neuroscience Methods. 299, 8-15 (2018).</li>
<li>Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neuronal+ensembles+in+networks+of+primary+sensory+neurons+in+intact+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia.</a> Journal of Visualized Experiments. 192, e64826(2023).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, e2760(2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+dorsal+root+ganglia+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 3087(2019).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Es wird angenommen, dass die Akupunktur-Analgesie durch integrative Prozesse in der DRG moduliert wird, die ein Wechselspiel zwischen afferenten Impulsen aus Schmerzregionen und Impulsen aus Akupunkturpunkten beinhalten. Hier beschreiben wir ein aufwendiges Verfahren für die L6-DRG-Bildgebung. Die Vorteile der Bildgebung sind vielfältig, einschließlich einer bemerkenswerten räumlichen Auflösung, der Möglichkeit einer hocheffizienten Bildgebung großer Neuronenbereiche gleichzeitig und der Möglichkeit, spezifische zellulär...

<a href="https://app.jove.com/t/6596">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/65975">10.3791/65975</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/65975">In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons&#39; Response to Somatic and Visceral Stimuli</a>. The Authors section was updated.

Erratum: In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

Akupunktur, ein integraler Bestandteil der traditionellen chinesischen Medizin, hat weltweite Anerkennung vor allem für ihre Wirksamkeit bei der Schmerzbehandlung erlangt, einschließlich der Linderung chronischer viszeraler Schmerzen1. In den letzten Jahrzehnten hat sich unser Wissen über die zentralnervösen Mechanismen, die der Akupunktur-Analgesie zugrunde liegen, erheblich erweitert1,2. Der Erforschung der funktionellen Rolle der Neuronen der Spinalganglien (DRG) bei der Induktion der analgetischen Wirkung der Akupunktur bei der viszeralen Nozizeption wurde jedoch wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Viszerale Nozizeptions- und Akupunktur-Analgetika-Studien werden möglicherweise an primären sensorischen Neuronen unter Verwendung elektrophysiologischer Techniken oder anderer neuronaler Aufzeichnungsmethoden durchgeführt3,4. Solche Forschungen helfen dabei, die Beziehung zwischen somatischem und viszeralem Input von spezifischen Zielgeweben oder Zielorganen zu verstehen, und bieten wertvolle Einblicke in Erkrankungen im Zusammenhang mit Akupunktur, viszeralen Schmerzen, der Regulation des autonomen Nervensystems und verwandten Erkrankungen.
Als Neuronen erster Ordnung im somatosensorischen System werden Neuronen in DRG als primäre sensorische Neuronen bezeichnet, die eine wichtige Rolle bei der Übertragung von Informationen über die äußere Umgebung sowie den inneren Zustand in elektrische Signale und bei der Übertragung von Signalen an das zentrale Nervensystem (ZNS) spielen. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass die viszerale Nozizeption dominant von sensorischen Neuronen weitergeleitet wird, deren Zellkörper sich in der DRG5,6 befinden. Obwohl zahlreiche Forschungen den zellulären und molekularen Mechanismus von DRG-Neuronen bei akupunkturinduzierter analgetischer Wirkung auf viszerale Schmerzen aufgeklärt haben7,8, gibt es aufgrund technischer Schwierigkeiten nur sehr wenig Literatur über seine funktionellen Eigenschaften9. Verschiedene Methoden zur Aufzeichnung der neuronalen Aktivität im DRG, wie z. B. die Aufzeichnung peripherer Fasern, die Aufzeichnung der Einzelzell-Elektrophysiologie und die In-vivo-Kalziumbildgebung, können verwendet werden, um die Muster und Eigenschaften der Aktionspotentiale aufzuzeichnen, die entlang der Axone weitergegeben werden10. Die Aufzeichnung des DRG mit lose geflickten Glaselektroden ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken, um die Korrelation zwischen neuronalen Aktivitäten und verschiedenen Stimuli in vivo zu untersuchen11. Traditionelle Methoden wie die elektrophysiologische Aufzeichnung können jedoch nicht effizient eine ausreichende Zellzahl und unterschiedliche spezifische zelluläre Subtypen untersuchen, um viszeral-responsive Neuronen in vivo zu identifizieren.
Neben der Kodierung peripherer Empfindungen spielen DRG-Neuronen eine bedeutende Rolle bei der Übertragung von Akupunktursignalen an das zentrale Nervensystem. Traditionelle elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden bereits in großem Umfang eingesetzt, um die Regulation der Akupunktur auf abnormale Aktivitäten von DRG-Neuronen zu untersuchen, die durch pathologische Schmerzen induziert werden11. Geeignete Segmente der DRG müssen in Bezug auf die sensorische Innervation beobachtet werden. Lumbal (L) 6 DRG wurde im Allgemeinen beobachtet, um die Modulation des Dickdarms zu untersuchen 4.
Jüngste Fortschritte in der Entwicklung optischer und genetischer Methoden ermöglichen es, die Aktivität großer Populationen genetisch markierter Neuronen gleichzeitig zu untersuchen12. Es gibt jedoch noch einen Mangel an detaillierten Calcium-Bildgebungsverfahren zur Überwachung der neuronalen Aktivität in DRG unter viszeraler und somatischer Stimulation. Daher erklärt dieses Protokoll die Verfahren zur in vivo Beobachtung der Reaktionsfähigkeit von L6-DRG-Neuronen auf intrakolonale und Akupunkturstimulation. Die hier beschriebene Methode kann auch zur Detektion von Eigenschaften somatischer und viszeraler sensorischer Neuronen verwendet werden.
Die breite Anwendung und Förderung der Kalziumbildgebung stellt ein sehr effektives und praktisches Werkzeug für die Akupunkturforschung dar. In Anbetracht der oben erwähnten Vorteile der Kalziumbildgebung hätte diese Methode in der Akupunkturforschung weit verbreitet und angewendet werden müssen. Allerdings ist der Einsatz von Calcium-Bildgebung in der Akupunkturforschung noch relativ selten. Der Hauptgrund für diese Einschränkung kann die Schwierigkeit der Betriebs- und Aufzeichnungsverfahren sein. Der Hauptzweck dieses Artikels besteht darin, einen Überblick über einige kritische Punkte bei der Durchführung von Kalzium-Bildgebungsaufzeichnungen von L6-DRG-Neuronen bei Mäusen zu geben. Vor allem aber hoffen wir, den Fortschritt und die Entwicklung der Akupunkturforschung durch den Einsatz dieses hochmodernen Werkzeugs in vivo zu fördern.

<table><tbody><tr><td>Anästhesie-System&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperaturregler</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperaturregler Heizkissen</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi Software</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Gelatineschwämme</td><td>Coltene</td><td>274-007</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Han' s Akupunktur-Nervenstimulator</td><td>Jason Scientific</td><td>HANS-200A</td><td></td></tr><tr><td>Intubationskanüle</td><td>Harward Apparatus</td><td>73-2737</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>RWD</td><td>R510</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td></td><td>Leica N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-cre Mäuse</td><td>Johns Hopkins University</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-GCaMP6s&nbsp; Mäuse (AI96)</td><td>Jax Laboratory</td><td>28866</td><td></td></tr><tr><td>Wirbelsäulenadapter</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Tribromethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15019-10</td><td></td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus kalzium-bildgebung der reaktion von neuronen der spinalganglien auf somatische und viszerale reize

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

Es wird eine Technik zur chirurgischen Freilegung des Spinalganglions (DRG) des lumbal-6 in einer lebenden, anästhesierten Labormaus beschrieben, zusammen mit dem Protokoll für die in vivo Calcium-Bildgebung des exponierten DRG als Reaktion auf verschiedene viszerale und somatische Reize. Pirt-GCaMP6s-Mäuse oder C57BL6-Mäuse, die intrathekal mit AAV-Viren injiziert wurden, die mit GCaMP6s verpackt waren, wurden verwendet, um Ca2+-Transienten zu erfassen. Die Amplitude dieser Transienten zeigt die Empfindlichkeit gegenüber spezifischen sensorischen Modalitäten an. Afferente Fasern stammen aus inneren Organen, wobei sich die primären neuronalen Zellkörper in den Spinal- oder Vagalganglien befinden. Studien zur viszeralen Nozizeption und Akupunktur-Analgesie können möglicherweise an primären sensorischen Neuronen unter Verwendung fortschrittlicher Bildgebungstechnologien wie der In-vivo-Kalziumbildgebung durchgeführt werden, die die Aufzeichnung von neuronalen Aktivitätsensembles im intakten Tier während der Stimulation oder Intervention ermöglichen. Es wurden die Reaktionen von DRG-Neuronenensembles auf somatische und viszerale Stimuli erfasst, die an ihre entsprechenden rezeptiven Felder appliziert wurden. Diese Technik zeigt, wie neuronale Populationen auf verschiedene Arten von somatischen und viszeralen Reizen reagieren. Es ist möglich, neuronale Ensemble-Reaktionen auf verschiedene Reize umfassend zu vergleichen, was ein besonders wertvoller Ansatz in der Forschung zu viszeralen Schmerzen und segmentalen Mechanismen der somatischen Stimulation, wie z.B. der Akupunktur, ist.

Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll wurde das Lenden-6-Rückenwurzelganglion einer transgenen Pirt-GCaMP6s-Maus freigelegt, und viszelle CRD- oder somatische Akupunkturreize wurden auf das Kolorektum bzw. das rezeptive Feld appliziert. Das Ziel dieses Experiments bestand darin, die Anzahl und Art der Neurone zu beobachten, die durch verschiedene viszerale CRD- und somatische Reize hervorgerufen werden.
Wie in Abbildung 2A gezeigt, weisen die meisten Neuronen im ...

Das vorliegende Protokoll beschreibt in vivo Calcium-Bildgebung zur Messung der Reaktionen von Ensembles von lumbal-6 DRG-Neuronen auf somatische und viszerale Reize. Neuronen, die auf unterschiedliche Reize reagieren, lassen sich gründlich vergleichen. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Untersuchung von Mechanismen des viszeralen Schmerzes und der somatischen Stimulation, wie z. B. der Akupunktur.

im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung der Reaktion von Neuronen der Spinalganglien auf somatische und viszerale Reize

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

in-vivo-calcium-imaging-dorsal-root-ganglia-neurons-response-to

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Shannonhouse, J., et al. In vivo Kalzium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Spinalganglien. J. Vis. Exp. (2023). Das Video zeigt eine in vivo Calcium-Bildgebungstechnik zur Überwachung der neuronalen Aktivität in den Spinalganglien (DRG) einer transgenen Maus. DRG-Neuronen exprimieren einen Kalziumindikator, der die Fluoreszenzintensität bei Bindung an Kalzium erhöht. Mechanische oder thermische Reize, die auf eine Hinterpfote...

In vivo Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in den intakten Spinalwurzelganglien einer Maus

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Diese Studie stellt eine chirurgische Manipulation vor, um das T-DRG in anästhesierten Mäusen für die in vivo Kalziumbildgebung freizulegen, zusammen mit synchronen EKG-Aufzeichnungen. Diese Methode stellt ein hochmodernes Werkzeug dar, um die periphere elektrische Nervenstimulation und die Eingänge der thorakalen viszeralen Organe sowie deren Wechselwirkungen auf der primären sensorischen Ebene zu untersuchen.

In-vivo-Calcium-Bildgebung und EKG-Aufzeichnung von thorakalen dorsalen Wurzelganglien (DRG) zur Untersuchung der peripheren Nervenstimulation

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Wir stellen eine Methode zur Chromatinimmunpräzipitation aus Spinalganglien Gewebe nach axonalen Verletzungen. Der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetische Modifikation von Histon-und DNA wichtig für die Regeneration von verletzten Axonen sowohl in den peripheren und zentralen Nervensystems zu identifizieren.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

Spinalganglien (DRG) sind Strukturen, die die sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems. Wenn distanziert, sie co-kultiviert mit SC-wie Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sein kann, eine wertvolle Modell zur in-vitro-Nervenregeneration und Myelinisierung zu untersuchen, imitiert die in vivo-Umgebung an der Verletzungsstelle.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Lernen Sie die In-vivo-Kalzium-Bildgebung von L6-Dorsalwurzelganglion-Neuronen bei somatischen und viszeralen Reizen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen neuronaler Aktivität und liefert Einblicke in Schmerzmechanismen sowie Akupunkturwirkungen.

im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung der Reaktion von Neuronen der Spinalganglien auf somatische und viszerale Reize

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