Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten.
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Methodenartikel
Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Allerdings sind viele der retinalen Nervenzellen, wie Amakrinzellen, erweitern ihre Dendriten horizontal, so dass die Morphologie der Zellen soll zu stark in den vertikalen Scheiben beschädigt werden. In der ganzen-mount Vorbereitung, insbesondere für Patch-Clamp-Aufnahmen sind Netzhautneuronen in der mittleren Schicht nicht leicht zugänglich durch die umfangreiche Berichterstattung von Gliazellen (Mueller-Zelle) s endfeets. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten. Die Scheibe wurde horizontal an der inneren Schicht der Netzhaut mit einem Vibratom Allesschneider gemacht, nachdem der Netzhaut in der Tieftemperatur-Agarose-Gel eingebettet war. In diesem horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut, untersuchten wir die Funktion der Netzhaut Neuronen im Vergleich zu ihrer Morphologie, mit Patch-Clamp-Aufzeichnung, Kalzium-Imaging-Technik, Immunzytochemie und Einzelzell-RT-PCR.
Protokoll
- Bereiten Sie eine Agar-Block (30 mg / ml, dh 3%, in destilliertem Wasser). Auflösen und Mikrowelle es zuerst und gießen Sie sie in einer Glasschale. Halten Sie das Gericht in einem Kühlschrank bei 4 ° C.
Tipp: Die Agar-Block sollte im Vorfeld vorbereitet werden.
- Bereiten Sie bei niedrigen Temperaturen schmelzende Agarosegel (25 mg / ml, dh 2,5%, in Medium). Auflösen und Mikrowelle es. Halten Sie es in dem heißen Wasserbad bei 35 o C.
Tipp: Halten Sie das Agarosegel nicht zu heiß. Wenn es zu heiß ist, dauert es eine lange Zeit verfestigt werden, und das Gel kann die Netzhaut zu töten
. - ....
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Diskussion
Es gibt mehrere wichtige Vorteile der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut.
Zunächst wird die Morphologie der Zellen, die Dendriten erweitern horizontal wie Amakrinzellen und horizontale Zellen, erhalten. Es hat sich gezeigt, dass es über 20 Arten von Amakrinzellen in der Netzhaut (MacNeil und Masland, 1998), so dass es ganz wichtig ist, die Morphologie der Zellen mit der physiologische Eigenschaft zu vergleichen.
Zweitens, in der ganzen-mount Netzhaut verhindert, dass die umfangreiche Berichterstattung von Gliazel.......
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Offenlegungen
Alle experimentellen Protokolle wurden nach Angaben des National Institutes of Health Richtlinien für Tierversuche durchgeführt.
Danksagungen
Wir danken Drs. Richard H. Masland und Akimichi Kaneko, dass sie uns wertvolle Hinweise und Anregungen an das Verfahren der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut zu etablieren.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Typ I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2, 1,0 MgCl2, 23 NaHCO3 und 10 Glukose, pH-Wert 7,8; oder Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Mikrowelle | |||
| Heißwasserbad | 35 °C | ||
| Vibratomschneider | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membranfilter | EMD Millipore | HAWP01300 | Filterpapier, Porengröße 0,45 µm |
| Präparationswerkzeuge | Pinzette, Klinge, Zange, etc. | ||
| Sofortkleber | z. B. Alonalpha, Krazy Glue | ||
| 50-mL-Spritze | |||
| Spritzenfilter | EMD Millipore | SX0001300 |
Referenzen
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
